GFP表达载体的构建及其在尖孢镰孢菌中的转化

【作者】 张硕； 刘限； 赵柏霞； 孔婷婷； 王敏； 高增贵；

【机构】 沈阳农业大学植物免疫研究所；

【摘要】 由于绿色荧光蛋白（Green FluorescentProtein,GFP）具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点,近年来以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。为揭示尖孢镰孢菌菌株在植株体内的侵染进程,本研究将质粒pEGFP中的绿色荧光蛋白基因（gfp）片段整合到带有真核表达启动子的骨架载体pBC-hygro上。并通过PCR和限制性双酶切鉴定,证明gfp基因已经被成功的整合到pBC-hygro上,真核表达重组载体pBC-hygro-GFP构建成功。进一步采用PEG-CaCl₂介导的原生质体遗传转化法,将GFP重组表达载体pBC-hygro-GFP转入黄瓜枯萎病菌菌株F-H.SY0975中,通过潮霉素抗性筛选和显微镜荧光观察,筛选出了3株荧光表达强烈的转化子,再通过转化子基因组的gfp片段扩增,确定GFP表达载体已成功标记黄瓜枯萎病菌菌株F-H.SY0975,继代培养5次,最终得到稳定遗传的转化子。为进一步研究尖孢镰孢菌的致病机制,探明不同专化型镰孢菌致病性差异存在的原因奠定基础。更多还原