生防绿色木霉几丁质酶基因Tvchi cDNA的克隆与表达特性分析

【作者】 杨丽荣； 姚刚林； 孙虎； 全鑫； 薛保国；

【机构】 河南省农业科学院植物保护研究所/河南省农作物病虫害防治重点实验室；

【摘要】 本文以绿木霉ZBS-6菌株为研究对象,利用RT-PCR方法扩增出编码全长Tvchi基因的cDNA序列,测序结果表明,绿木霉ZBS-6菌株Tvchi基因核苷酸序列全长为1293bp(GenBank登录号:GQ406361),编码430个氨基酸残基;同源性分析表明,本次获得的绿木霉ZBS-6 Tvchi基因属于第18家族的几丁质酶,同NCBI上已知的绿色木霉(Trichoderma viride)ech1基因(AF397020.1)有高度的同源性,同源性在98%以上。与哈茨木霉(T.harzianum,U49455.1)同源性在90%,与钩状木霉(T.hamatum,AB041754.1)同源性在93%。并构建pET-28a/Tvchi原核表达载体,获得了Tvchi-His融合表达的蛋白,SDS-PAGE分析表明,Tvchi基因能在大肠杆菌BL21中表达,检测到约47kD的Tvchi融合外源蛋白,Westem印迹分析pET-28a/Tvchi原核表达载体,检测到约47 kD的Tvchi-His融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为100 mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。Tvchi在20～37℃酶活迅速升高,在37℃时达到最高,在pH值为6～8时具有较高的酶活活性,抑菌活性分析表明表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究Tvchi抑菌蛋白以及抗病转基因工程提供了参考。更多还原