利用酵母双杂交系统筛选与ToMV CP、MP和CMV 2b相互作用的寄主因子

【作者】 王子华； 梁学超； 林涛； 苏海娣； 崔百明； 郑银英； 向本春；

【机构】 石河子大学生命科学学院/农业生物技术重点实验室；

【摘要】 为了研究番茄病毒与寄主植物加工番茄的相互作用和ToMV和CMV的致病机制和寄主的抗病作用机理及开发具抗病种质资源加工番茄新材料。利用酵母双杂交系统从加工番茄cDNA文库中筛选出了可能与ToMV CP、MP和CMV 2b具有互作关系的寄主因子,将目的基因CP、MP、2b克隆到酵母双杂交诱饵载体pSos上,构建了诱饵载体pSos-CP、pSos-MP、pSos-2b。CP、MP、2b三个蛋白对酵母菌cdc25H均未表现出毒性和自激活活性。同时提取接种ToMV和CMV诱导的加工番茄幼苗叶片总RNA,通过CytoTrap XR library construction kit构建了加工番茄酵母双杂交cDNA文库。分别将诱饵质粒pSos-CP、pSos-MP、pSos-2b与文库质粒共转化至酵母菌cdc25H中,在二缺营养缺陷型培养基和限制温度37℃及半乳糖诱导下筛选可能与诱饵蛋白互作的阳性克隆。提取阳性克隆质粒并筛选出文库质粒,通过PCR鉴定阳性克隆子中cDNA插入片段的大小和酶切验证并送测序。用不同的诱饵初步筛选cDNA文库分别获得了不同阳性克隆:以pSos-CP为诱饵,从文库中筛选获得9个阳性克隆;以pSos-MP为诱饵,从文库中筛选获得28个阳性克隆;以pSos-2b为诱饵,从文库中筛选获得7个阳性克隆。在NCBI数据库中对测序结果进行Blast比对。根据数据库中阳性克隆对应同源序列的相关信息,对相同的克隆进行分类合并及功能分析。根据测序和比对的结果,初步筛选到了几个寄主因子。目前对这些寄主因子的互作验证及其功能进一步研究工作正在进行中。更多还原