14-3-3蛋白与磷酸化的NF-L结合调节神经丝的组装

【作者】 缪林清； 林继强； 滕俊琳； 陈建国；

【机构】 北京大学生命科学学院；

【摘要】 神经丝(neurofilament,NF)由3种不同分子量大小的神经丝蛋白:NF-L,NF-M,NF-H共同装配而成。这3种蛋白均由N端头部区,保守的杆状区和C端尾部区构成。头部区和尾部区均有一些位点可以被磷酸化,头部的磷酸化影响NF的组装,尾部的磷酸化则影响神经丝蛋白在神经元轴突中的运输以及和其他细胞结构成分的作用。在多种神经退行性疾病中,都有神经丝的异常磷酸化与聚集,但这个过程的分子机制尚不清楚。已知14-3-3蛋白家族经常参与磷酸化蛋白的调节,为了研究14-3-3蛋白是否参与神经丝组装过程的调节,我们原核表达了小鼠中的七种14-3-3蛋白的GST融合蛋白,跟小鼠大脑匀浆液孵育做pull-down实验,发现7种14-3-3蛋白中β,γ,ξ,η四种亚型明显结合NF-L,但是没检测到与NF-M和NF-H的结合。为了确定14-3-3γ结合NF-L的具体区域和位点,我们构建了一系列NF-L的缺失突变体和模拟磷酸化突变体,缺失突变体的结果显示,尾部区域缺失后NF-L△T形成点状聚集体,并且与14-3-3γ很好共定位;而头部区域缺失后,NF-LAH在细胞中弥散分布,与14-3-3γ没有明显共定位。NF-L点突变体的pull-down结果显示NF-L头部区域的S56D突变体跟14-3-3γ结合。我们检测了全长NF-L头部区域的点突变体与内源的14-3-3γ在SW13 vim-细胞中的定位,发现NF-L的S56D和S58D突变体在SW13 vim-细胞中与内源的14-3-3γ共定位,不能自组装成丝;而S56A和S58A突变体能够自组装成丝,但是不和14-3-3γ共定位;而且野生型的NF-L和14-3-3γ共转染SW13 vim-细胞后,过量表达的14-3-3γ影响NF-L的自组装。因此我们认为14-3-3γ和NF-L的相互作用依赖于NF-L头部Ser56和Ser58的磷酸化,而且14-3-3γ的结合影响了NF-L的自组装成丝过程。更多还原