SUMO-1修饰ataxin-3蛋白对其泛素化、降解、包涵体形成、细胞凋亡等的影响

【作者】 沈璐； 周亚芳； 廖书胜； 汤建光； 杜鹃； 唐北沙；

【机构】 中南大学湘雅医院神经内科；

【摘要】 脊髓小脑型共济失调3型/马查多-约瑟夫病(SCA3/MJD)为最常见的遗传性共济失调。其发病是由于致病基因MJD1编码区内3’端的CAG重复序列异常扩增导致其编码产物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)肽链异常扩展引起。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是新近发现的一类重要的蛋白质翻译后修饰因子。SUMO-1修饰主要与底物蛋白的亚细胞定位、转录调控、蛋白质稳定性的调节等方面密切相关。目前研究发现SUMO-1存在于阿尔茨海默病、多系统萎缩、多聚谷氨酰胺疾病、帕金森病等多种神经退行性疾病的包涵体中。同时,很多与神经退行性疾病相关的蛋白被发现是SUMO-1的底物蛋白,苏素化可能参与了其生理及病理过程。在前期工作中,我们发现并证实ataxin-3蛋白以其氨基端与SUMO-1相互作用,SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的关键氨基酸位点均为第166位赖氨酸;SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白并未改变其亚细胞定位。目的从真核细胞水平探讨SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的泛素化水平、降解情况、胞浆/胞核分布、核内包涵体形成、细胞凋亡率的影响。方法应用亚细胞组分分离技术、免疫共沉淀技术、脉冲追踪实验技术、双染流式细胞仪技术等分析存在或缺失苏素化修饰的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的胞浆/胞核分布、泛素化水平、降解情况、核内包涵体形成及细胞凋亡率的差异。结果亚细胞组分分离发现存在或缺失SUMO-1修饰位点对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的胞浆/胞核分布无明显影响。免疫共沉淀结果显示在外源性过表达SUMO-1或缺失SUMO-1修饰情况下,野生型与含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平可见明显差别,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平更高;在外源性过表达SUMO-1或缺失SUMO-1修饰情况下,野生型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平无明显改变;同样,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平也无明显改变。追踪实验发现野生型ataxin-3及其K166R突变体随时间延长蛋白逐渐降解,条带变化基本一致,无明显差异;而含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白在第7小时、第15小时的条带均明显比含polyQ异常扩展突变型ataxin-3-68Q-K166R突变体同时间点的条带浓,说明含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白在存在SUMO-1修饰时变得更为稳定,降解明显减慢。随机双盲试验分析野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白核内包涵体有明显差异(P<0.005),说明polyQ的次数增加可导致核内包涵体的形成;在野生型组、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组内比较时,有或无外源性过SUMO-1修饰、存在或缺失SUMO-1修饰位点时,核内包涵体的数目无明显差异。PI/Annexin V-FITC双染流式细胞仪结果显示:含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组与其K166R突变体组比较,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组的早期凋亡率要高于含polyQ异常扩展突变型ataxin-3-K166R突变体组,存在显著性差别(P<0.005),说明SUMO-1修饰含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白对细胞有毒性作用,增加了细胞的凋亡率;野生型ataxin-3及其K166R突变体组间早期凋亡率未见明显差别(P>0.005),说明SUMO-1修饰野生型ataxin-3蛋白无明显细胞毒性作用。结论 SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白不能改变其胞浆/胞核分布、泛素化和核内包涵体形成,但能延缓突变型ataxin-3蛋白的降解,增加其细胞毒性,提示SUMO-1修饰可能参与了SCA3/MJD的致病过程。更多还原