小鼠胚胎干细胞Notchl基因沉默对Dvl-1和JNK-3表达的影响

【作者】 韩雪飞； 李佳； 赵庆霞； 申一疼； 许燕； 鄢文海； 邢莹；

【机构】 郑州大学基础医学院；

【摘要】 已有研究证明,在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)中存在一种"旁侧抑制"即位于ESC表面的Notchl可与邻近细胞表面的配体Delta结合,抑制其下游bHLH(basic helix-loop-helix)家族神经分化基因如Mash1、NeuroD等的转录,从而抑制ESC向神经细胞转化。因此,当Notch1下调后,可以使ESC从"旁侧抑制"中释放出来,进而促进ESC向神经细胞分化。但目前通过抑制Notch1而促进ESC向神经细胞分化的研究尚无报道。为此,我们利用RNA干扰技术构建特异性Notch1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)真核表达载体抑制小鼠ESC中Notch1基因的表达,并检测dishevelled(Dvl)-1和c-jun terminal kinase(JNK)-3基因的mRNA表达变化,试图从信号转导途径分析Notch1表达受到抑制后的ESC功能变化,以预测通过抑制Notch1而促进ESC向神经细胞分化的可行性。根据GenBank提供的Notch1基因的核苷酸序列,按照Ambion公司网站的siRNA设计工具设计两对双链siRNA,先克隆入T载体,经筛选,鉴定,测序后,双酶切靶基因,再亚克隆入siRNA载体pSINsi-U6中构建重组体pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2,筛选,并用限制性内切酶酶切进行鉴定。将重组载体,空载体通过脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染小鼠ESC 48小时,同时在瞬时转染的基础上,利用该载体带有新霉素抗性筛选系统,用G418筛选出阳性克隆,并用Real-Time PCR技术检测Notch1,Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达。Real-Time PCR结果显示:未转染组和空质粒组Notch1 mRNA的表达均无明显变化,而重组载体pSINsi-U6-1和pSINsi-U6-2两组Notch1 mRNA的表达明显下调,且当Notch1受到抑制后Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达均上调。Notch蛋白是一种跨膜受体蛋白,参与调节各种各样细胞分化及发育的信号转导途径,并影响了多种生长发育过程,亦与某些中枢系统疾病(如Alzheimer病)的发生相关。本实验中,Notch1抑制后Dvl-1和JNK-3 mRNA的表达上调,这与以往研究结果相同,而Dvl-1和JNK-3表达上调可以抑制神经元纤维盘结和老年斑(Alzheimer病的两个特征性病理改变)的形成,进而对神经细胞起到了保护作用。由此我们可以推测在Notch信号转导途径受到抑制后,ESC向神经细胞分化的过程中是向着有利于完善神经细胞的功能方向发展的。这提示我们可以通过RNAi技术,人为的调控Notch1表达,增强ESC向神经细胞定向分化的有效性和可控性。这为实现ESC的定向分化以及为神经系统病变的治疗提供充足的细胞来源奠定了基础。更多还原