玉米弯孢霉叶斑病菌毒素相关基因与色素相关基因相互关系研究

【作者】 荆晶； 刘铜； 范莉莉； 刘力行； 陈捷；

【机构】 上海交通大学农业与生物学院；

【摘要】 玉米弯孢霉叶斑病菌（Curvulaira lunata）产生的毒素和黑色素均是重要的致病因子,因此研究毒素合成相关基因Clt-1和黑色素形成相关基因Brn1的相互关系,有助于更全面揭示弯孢霉叶斑病菌的致病机理。根据已知的Brn1基因序列作为探针,通过Southern blotting确定了Brn1基因以单或多拷贝的形式存在于基因组中,为此,以质粒pSilent-1为基础构建了Brn1基因的RNA干扰载体pSilentBrn1-2,并利用原生质体-氯化钙-聚乙二醇（CaCl₂-PEG）转化方法获得了10个抗潮霉素的转化子,其中转化子T2、T4、T5在菌丝颜色上表现出不同程度的白化现象。通过转化子Southern blotting和RT-PCR验证,发现其干扰载体pSilent-brn1中Brn1基因序列的发夹结构已经整合到基因组中,并且Brn1基因表达有不同程度被抑制,其中转化子T5中Brn1基因表达被沉默程度达79%,菌落表现红棕色,边缘出现白化,表明DHN黑色素合成过程中受阻。通过TLC检测发现T5不能产生所鉴定的毒素分子—（甲基-（5羟甲基）呋喃-2-羧酸盐）。综上述表明:Brn1基因不仅是弯孢霉叶斑病菌黑色素合成途径中关键基因,而且还参与了毒素合成代谢的调控。为了进一步明确两基因是否存在直接的互作关系,本研究正在利用酵母双杂交方法进行研究。已开展工作如下:以玉米弯孢霉叶斑病菌野生菌株CX-3为试验材料,收集生长两天的菌丝提取总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,以此为模板用高保真酶扩增出Brn1和Clt-1目的片段,加A尾后做T-A克隆,转化感受态大肠杆菌DH5α,做菌落PCR后并将阳性菌种保存。进一步验证是否连上T载体,即提取质粒后进行酶切,发现目的片段后进行测序,测序结果正确,于是将质粒与相应载体分别酶切并进行连接,构建pGBKT7-Brn1和pGADT7-Clt-1融合质粒。再将融合质粒转入感受态DH5α,将可能含有pGBKT7-Brn1融合质粒的DH5α涂布于含有卡那霉素平板,而pGADT7-Clt-1则涂布于氨卞霉素平板,挑选阳性克隆并做菌液PCR,确认为阳性后提取融合质粒转入酵母菌株AH109中,涂板,共4种平板（-Trp-Leu-Trp-leu-Trp-leu-His-Ade）,四缺板上的单菌落再进行X-a-gal显示验证。更多还原