狂犬病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

【作者】 高明华； 夏咸柱； 薛琳； 沈为明； 韩启茂；

【机构】 军事医学科学院军事兽医研究所； 吉林大学畜牧兽医学院； 内蒙古扎兰屯农牧学院； 内蒙古阿荣旗动物防疫监督所；

【摘要】 狂犬病是一种重要的人兽共患病,近几年在我国发生呈持续上升趋势,稳居我国法定报告传染病发病总数和死亡总数之第二位,病死率和死亡率则位居各传染病首位,因此研制安全有效的疫苗和建立特异敏感的快速诊断方法对于防控狂犬病是非常必要的。我们对狂犬病毒(RV)ERA株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的RV N基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对RV ERA株N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353 bp,编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD-B19株相比,核苷酸的同源性分别为98%、98.3%、99%、99.6%,推导的氨基酸的同源性分别为98%、99%、99%、99.6%。将pTN双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,构建了重组质粒pETN;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为50.5KD的重组蛋白,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与RV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的66.8%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测RV抗体间接ELISA用的包被抗原。更多还原