表达绿色荧光蛋白的单核细胞增生李斯特菌lmo1078缺失突变株的构建

【作者】 张红娟； 陈军； 李素芳； 沈金慧； 李白； 言思敏； 林佳楠； 徐晓晖；

【机构】 中国计量学院生命科学学院； 中国计量学院现代科技学院；

【摘要】 以绿色荧光蛋白基因(egfp)为外源基因,以单核细胞增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesEGD)野生型菌株lmo1078基因为靶基因,通过基因切割-重叠延伸PCR(SOEing PCR)及同源重组技术构建表达GFP蛋白的单核细胞增生李斯特菌lmo1078基因缺失突变株.首先从单核细胞增生李斯特菌EGD菌株基因组中扩增lmo1078基因的上游A片段和下游B片段,从pEGFP-N3质粒中PCR扩增EGFP片段(简称E),利用SOEing PCR技术,先将AE和EB片段连接,再将AE和EB片段连接为AEB片段,利用BamH I单酶切将AEB连接到穿梭载体pMAD中,转化大肠杆菌DH5α,保存pMAD-AEB重组质粒。质粒PCR产物经测序证实构建的pMAD-AEB重组质粒序列正确.将pMAD-AEB重组质粒电转化单核细胞增生李斯特菌野生型菌株,利用pMAD中所带的ts和bgaB基因的特性,进行温度和蓝白斑筛选,获得单核细胞增生李斯特菌重组菌株.以单核细胞增生李斯特菌基因组中lmo1078基因下游B片段外侧+75bp设计引物与AEB中的E片段(EGFP)上游引物进行PCR,PCR产物经测序证实EGFP片段确实已经替换基因组中lmo1078基因ORF框序列.但是利用荧光显微镜观察重组菌落未见荧光特征。更多还原