抗菌肽V13KL与EGFP共表达载体的构建及在COS-7细胞、小鼠胚胎中表达的初步分析

【作者】 关继羽； 张鹏； 宋光启； 刘丽梅； 王中伟； 唐博； 陈育新； 李子义；

【机构】 吉林大学畜牧兽医学院动物胚胎工程吉林省重点实验室； 长春普莱医药生物技术有限公司；

【摘要】 目的:V13KL是人工化学合成的抗菌的多肽,具有高效的杀菌性和较低的溶血性,可以作为临床上比较有前景的候选抗菌药物。本实验旨在将该抗菌肽的cDNA序列构建到真核表达载体上,通过转染COS-7细胞和原核注射的方法研究其表达活性,为最终获得抗抗特定病原菌的转基因动物奠定基础。方法:本课题的合作单位长春普莱医药生物技术有限公司提供抗菌肽V13KL的专利氨基酸序列,并将其反转为cDNA序列形式,通过SOE PCR的方法合成该V13KL的cDNA,将其连入pMD18-T载体进行测序;将此序列及pIRES2-EGFP用限制性内切酶Xhol和EcoRl进行双酶切后连接、转化、提取融合质粒、测序;将所获得的融合质粒以FuGENE HD转染COS-7细胞,转染条件:脂质体FuGENE HD与质粒pIRES2-EGFP-V13KL的比例(ul FuGENE HD:ug DNA)为6:2,COS-7细胞的汇合度为90%时转染细胞,转染复合物(不含血清)为100ul,转染时间为6-8小时,转染后换成10%FBS、1%双抗的DMEM培养液,转染后24-48小时用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况;将所获得的融合质粒线性化后以原核注射的方法注入小鼠受精卵以检测其对胚胎发育影响。结果与结论:通过SOE PCR获得的V13KL的cDNA序列经测序与原设计序列相符;经PCR、双酶切鉴定表明V13KL的cDNA已经成功连入pIRES2-EGFP表达载体中;经转染试剂FuGENE HD做瞬时转染,转染后48小时荧光镜检测80%的细胞表达绿色荧光,表明目的抗菌肽V13KL与EGFP在IRES序列元件的介导下得到了高效共表达;将线性化的融合载体对小鼠的50枚受精卵进行原核注射最终获得带有绿色荧光的囊胚6枚,且胚胎状态良好,未见异常,表明V13KL不影响囊胚前期的胚胎的正常发育。本实验将抗菌肽V13KL在COS-7细胞中的高效表达及在小鼠囊胚前期的表达分别为后续真核系统表达手段获得V13KL多肽及对其进行转基因动物抗菌功能的验证提供了重要的实验依据。更多还原