猪肝脏喹赛多作用相关基因的鉴定

【作者】 戴梦红； 于瑞； 王国永； 姚敏； 王玉莲； 袁宗辉；

【机构】 华中农业大学国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部食品安全评价重点开放实验室华中农业大学动物医学院；

【摘要】 【目的】应用mRNA差异显示技术,研究在喹赛多作用下猪肝脏组织中差异表达的基因,探讨喹赛多作用分子机制,寻找喹赛多作用的生物标志物。【方法】将18头断奶仔猪随机分为3组,每组6头,分别为空白对照组、喹赛多100mg/kg饲料组和500mg/kg饲料组,实验期为21天。猪只屠宰后立即采取肝脏组织,放液氮速冻后转到-80℃冰箱保存。应用Trizol试剂从猪肝脏组织中提取总RNA,并用DNaseⅠ消化除去RNA中可能存在的痕量DNA,以降低假阳性的发生率。应用琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度法鉴定RNA质量和纯度。以cDNA为模板,采用改进的差异显示锚定引物和随机引物进行扩增,运用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染的方法,分离筛选差异条带。用改进的方法回收差异条带,并进行二次扩增。PCR产物纯化后与质粒载体pMD18-T Simple Vector连接,转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。质粒酶切和菌液PCR鉴定阳性克隆并测序,获得差异基因片段的DNA序列。采用Northern斑点杂交和反向Northern斑点杂交技术相结合的方法,并运用分子生物学软件Image-pro plus 6.0对显色结果进行灰度值计算,对获得的差异显示片段进一步鉴定。将所得喹赛多作用相关差异基因的DNA序列,通过BLAST工具分别对GenBank数据库中猪、人、小鼠和牛的核苷酸序列和蛋白质数据库中的氨基酸序列进行同源性分析和开放阅读框(ORF)分析。【结果】喹赛多可显著提高仔猪平均日增重,与空白组相比,低和高剂量组分别增加了24.7%and 64.8%(p<0.01),临床推荐剂量的10倍剂量(500mg/kg饲料组)没有发现任何毒性症状。实验最终得到8条与喹赛多作用相关的差异基因。其中5条基因的表达量与喹赛多剂量呈正相关,分别是猪的表皮生长因子、锌指结构、抗细胞衰亡因子1、胰岛素样生长因子-Ⅰ和C3补体成分。1条基因的表达量与喹赛多剂量呈负相关,可能是新基因。2条基因表达量上调,但随着喹赛多剂量的增加表达量不变,一个为猪转酮醇酶,一个与牛ADP聚合酶-4基因序列高度同源。【结论】在转录水平上,生长因子和代谢可能与喹赛多促生长活性有关,而免疫防治和免疫调节可能在喹赛多对猪的防病机制方面起着重要的作用。更多还原