重组人骨形态发生蛋白-7抗体的制备及检测

【作者】 安新玲； 王志宁； 刘肖帅； 葛鲁娜； 朱有名； 韩金祥； 王世立；

【机构】 山东省医学科学院山东省医药生物技术研究中心,卫生部生物技术药物重点实验室；

【摘要】 目的及意义:近几年来,国内外对于BMP-7的研究较多,但其研究多集中在BMP-7诱导骨形成的探索方面,而对抗体制备方面研究较少。本实验利用重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)制备抗体,同时通过制备的rhBMP-7抗体对骨形态发生蛋白-7(BMP-7)进行检测。方法:重组大肠杆菌发酵获得rhBMP-7包涵体,提取包涵体,经离子交换色谱法进行纯化,收集rhBMP-7蛋白峰,SDS-PAGE电泳分析rhBMP-7蛋白纯度可达95%以上;利用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定rhBMP-7蛋白溶液浓度;加福氏佐剂制备rhBMP-7免疫蛋白,采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,每只动物每次免疫剂量0.75mg,免疫前一天耳源静脉采血作为阴性对照,每次免疫间隔两周,共免疫四次,免疫动物颈动脉插管取血;ELISA法测定抗血清的效价;通过蛋白免疫印迹技术(Western blot)确定抗血清特异性,最佳的稀释度、灵敏度,并检测与牛血清、小鼠及其它动物不同组织蛋白的结合效果。结果:Bradford法测定rhBMP-7蛋白溶液浓度为1.5mg/ml;ELISA法测定抗血清效价达到了1:640,000;从小鼠骨组织及肾脏组织中提取的蛋白与抗血清具有良好的结合特异性,经Western blot确定抗血清检测rhBMP-7的最佳稀释度为1:5000-1:50000,灵敏度为1ng-100ng。结论:利用重组大肠杆菌发酵获得的rhBMP-7,经纯化后免疫新西兰大白兔制得了rhBMP-7抗体,经检测,抗体具有很高的特异性及灵敏度,可以用于ELISA、免疫组织化学及Western blot检测。更多还原