陆地棉纤维表达蛋白基因GhCFE的功能研究

【作者】 吕芬妮； 郭旺珍；

【机构】 南京农业大学农学院；

【摘要】 棉花是世界性重要的经济作物。棉纤维是世界上最重要的纺织原料之一,是由种子胚珠外表皮细胞经过一系列发育调控形成的。阐明棉纤维发育重要基因功能对理解单细胞结构的棉纤维发育机理,进而通过分子育种手段改良棉纤维品质具有重要意义。本实验利用反向遗传学技术,研究陆地棉纤维表达蛋白(cotton fiber expressed protein,CFE)基因在棉纤维发育中的功能。通过筛选从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库获得GhCFE cDNA克隆,该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码331个氨基酸,与已报道的3个陆地棉纤维表达蛋白CFE1,CFE2和CFE3的相似性分别达到了95%,98%和96%(郭瑛等2006)。蛋白预测显示其N端具有一个26个氨基酸残基的信号肽,推测GhCFE是一个蛋白前体,合成之后将运输到其作用部位或被分泌到细胞外;通过原核表达技术,从大肠杆菌中纯化到预期大小的棉纤维表达蛋白,说明GhCFE1274bp的cDNA序列可有效翻译;RT-PCR分析显示,GhCFE在根、茎中几乎不表达,在叶中微弱表达,在胚珠和不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在短绒起始期(5DPA)的表达量最高;同时,GhCFE-GFP融合载体在洋葱表皮细胞的核和膜以及拟南芥表皮毛中瞬时表达,而在拟南芥叶片细胞中不表达,推测GhCFE是一个棉纤维优势表达的基因,且与短绒的起始发育可能相关。进一步利用pBI121质粒载体构建了CaMV35S启动子的正义表达载体(35SC),E6棉纤维专化表达启动子驱动的正义表达载体(E6SC)和反义表达载体(E6ASC)进行转基因功能验证,分别获得组成型表达、在纤维细胞中特异表达、在纤维细胞中抑制表达的转基因植株;对每个再生单株进行NPTII和启动子基因特异的PCR检测、卡纳筛选,经过连续2 3个世代的选择,共获得14个转基因纯合株系,纤维品质检测发现这些转基因纯系的纤维强度和细度变化不大,但35SC的4个转基因株系和E6SC的5个转基因株系都表现出短绒明显变少、纤维显著变短的表型,尤其35SC的4个转基因株系表现更为显著,而E6ASC的5个转基因株系短绒和纤维长度无明显变化;Southern杂交分析表明,转基因株系多数都只含一个或两个拷贝;RT-PCR分析发现,GhCFE在35SC的4个转基因株系和E6SC的5个转基因株系的胚珠和不同发育时期的纤维细胞中均显著高于WO品系表达,而且5DPA纤维中的表达量最高,尤其在4个35SC转基因株系5DPA纤维中的表达量都远远高于WO品系和转E6SC株系,同时在反义载体E6ASC的5个转基因株系胚珠和纤维中GhCFE并未受到显著抑制。这些结果表明,GhCFE基因是一个棉纤维优势表达的基因,其在棉花短绒起始期的高效表达使短绒起始受到部分抑制,是棉花短绒发育的负调控因子,同时对纤维的伸长也有一定的抑制作用。更多还原