hTERT/U6嵌合启动子对肝癌细胞的靶向作用分析

【作者】 张鹏辉； 姜习新； 涂植光；

【机构】 重庆医科大学附属儿童医院检验科； 重庆医科大学检验系临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室、重庆市重点实验室；

【摘要】 目的在课题组前期研究中,我们成功构建了hTERT/ U6嵌合启动子的shRNA表达载体。该启动子的特点是:对端粒酶表达阳性细胞具有靶向作用;并且可通过RNAi定向敲除或抑制靶基因表达。在本研究中,将进一步验证shRNA-EGFP-hTERT/ U6-PTZU6+1表达载体对肝癌细胞的靶向作用。方法:筛选、培养稳定绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常纤维细胞株HELF(EGFP-HELF)。将具有肿瘤靶向作用的shRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株为实验组;shRNA- EGFP-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株为实验对照组;PTZU6+1质粒转染EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株为空载体对照组。利用Real-time PCR和Western-blot鉴定shRNA-EGFP-hTERT/U6-FFZU6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响。结果:1.Real-time SYBR Green PCR:采用标准曲线定量法将每一标本检测所得EGFP拷贝数和相对应的内参基因GAPDH基因的拷贝数相除来进行标准化,对EGFP进行绝对定量。在EGFP-7721细胞中,shRNA-EGFP-PTZU6+1、shRNA- EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染组与PTZU6+1质粒转染组相比,GFP基因表达下调(P<0.05,n=3);在EGFP-HELF细胞株中,仅shRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染组与PTZU6+1空载体转染组相比,GFP基因下调(P<0.05,n=3);而shRNA-EGFP-hTERT/ U6-PTZU6+1质粒转染组与PTZU6+1空载体转染组相比,GFP基因表达无差异(P>0.05,n=3)。2.Western-blot:在EGFP-7721细胞组中,shRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染组与PTZU6+ 1质粒转染组相比,GFP蛋白表达明显下降,表达量(与内对照NADPH的灰度值比值)由(1.134±0.028)下降到(0.598±0.05)(P<0.01,n=3),两者间存在显著性差异;shRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染组与PTZU6+1空载体转染组相比,GFP蛋白表达也明显下降,表达量(1.134±0.028)降至(0.0.349±0.005)(P<<0.01,n=3)两者间也存在显著性差异;shRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染组与shRNA-EGFP-PTZU6+1相比,GFP蛋白表达无差别。在EGFP-HELF细胞组中,转染PTZU6+1质粒组,shRNA-EGFP- hTERT/U6-PIEU6+1质粒转染组,GFP蛋白表达量分别为(1.042±0.017)和(1.006±0.016),无显著性差别。而shRNA-EGFP-PTZU6+1转染组与PTZU6+1质粒组比较,GFP蛋白表达量由(1.042±0.017)降至(0.0586±0.014)(P<0.01,n=3),两者存在显著性差异。而在EGFP-HELF细胞株中,仅shRNA-EGFP-PTZU6+1转染组与PTZU6+1质粒组比较,GFP蛋白表达量下调(P<0.01,n=3);而shRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染组,与PTZU6+1质粒组比较无差异(P>0.05,n=3)。结论:shRNA-EGFP-hTERT/U6- PTZU6+1表达载体在肝癌细胞中具有靶向作用,为探讨恶性肿瘤的基因靶向治疗奠定了基础。更多还原