硼肽类蛋白酶体抑制剂衍生物抑制人乳腺癌细胞增殖及其机制初探

【作者】 徐波； 陈瑜； 张韵； 姚书扬； 李润涛； 崔景荣；

【机构】 北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室；

【摘要】 目的:观察硼肽类蛋白酶体抑制剂的衍生物A对细胞内外20S蛋白酶体活性及对人乳腺癌（MDA）细胞增殖的影响。探讨其引起MDA细胞周期阻滞及凋亡的作用机制,为寻找新的蛋白酶体抑制剂提供理论依据。方法:荧光法测定细胞内外20S蛋白酶体活性;SRB比色法检测MDA细胞增殖;流式细胞技术及高内涵（HCS）技术检测细胞周期和凋亡;蛋白免疫印迹法分析MDA细胞内蛋白表达的变化。结果化合物A能明显抑制体外纯化20S蛋白酶体的糜乳蛋白酶样（ChT-L）、PGPH和胰蛋白酶样活性（T-L）,其IC50值分别为0.049μM、0.175μM和0.959μM。但对其他蛋白水解酶:糜乳蛋白酶、胰蛋白酶和组织蛋白酶B却没有抑制作用。0.4μM化合物A作用于MDA细胞3h后,对蛋白酶体的ChT-L和PGPH活性的抑制率分别为92.37%和63.95%,但不影响T-L活性。细胞内多聚泛素蛋白也随着给药浓度的增加和作用时间的延长而聚集。化合物A能够显著影响MDA细胞增殖,其IC50值为0.079μM。0.1μM化合物A作用细胞12h后,处于G₂/M期的细胞百分率由对照组的1.82%增加到18.08%,作用36h后到达44.88%,且呈一定的浓度时间依赖性。周期相关蛋白Cyclin B1、cdc2的表达随化合物浓度的增加而降低,对磷酸化的cdc2-Tyr15蛋白作用具有浓度依赖性的增加,而对磷酸化的cdc2-Thr161则不受浓度变化影响。0.1μM化合物A作用36h能够引起MDA细胞产生凋亡,流式结果显示,处于subG1期的细胞由对照组的2.33%增加到16.0.2%。不同浓度的化合物A作用24小时,可使F-actin蛋白的表达显著增加,线粒体的膜电势的变化与给药浓度呈正相关性。凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3和Caspase-9发生裂解,与线粒体通路相关的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则随浓度的增加而减少。结论:化合物A能抑制人乳腺癌细胞的增殖,阻断细胞周期于G2/M期,并影响周期相关蛋白Cyclin B和cdc2及其磷酸化蛋白的表达;诱导细胞凋亡,并引起线粒体通路相关蛋白表达异常。其可能的抗癌机制与蛋白酶体活性抑制有关;更多还原