4-HPR诱导产生的活性氧对Akt1蛋白氧化还原及其磷酸化状态改变的机制研究

【作者】 曹戟； 闫艳； 苏毅； 何俏军； 杨波；

【机构】 浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所；

【摘要】 目的:探讨由抗肿瘤药物4-HPR刺激NB4细胞产生的活性氧(ROS)对Akt1蛋白氧化还原及其磷酸化状态改变的作用机制,阐明ROS对Akt1蛋白的翻译后修饰作用,以期揭示由抗肿瘤化合物诱发产生ROS时可能存在的一种共同作用方式。方法:Annexin-V/PI标记样本细胞,采用流式细胞术检测NB4细胞凋亡率;流式细胞仪定量检测经荧光探针DCFDA标记的细胞内ROS含量;流式细胞仪定量检测经荧光探针JC-1标记的细胞内线粒体膜电位变化情况;非还原性SDS-PAGE检测NB4细胞内Akt1蛋白的氧化还原状态改变;汞溴红染色样本细胞用于检测NB4细胞内二硫键生成情况;采用免疫沉淀及免疫荧光技术分析经4-HPR作用的NB4细胞内Akt1蛋白与HSP90及PP2A蛋白的相互作用情况;Western Blot法检测经4-HPR作用的NB4细胞内相关蛋白的含量改变。结果:(1)以无水乙醇为溶剂对照组,分别采用2.5、5.0、10.0μM浓度的4-HPR作用NB4细胞24小时,凋亡率分别为3.65%,22.60%,41.47%,62.25%,采用10.0μM浓度的4-HPR作用不同时间,其凋亡率呈现时间依赖性关系;(2)经10.0μM浓度的4-HPR分别作用NB4细胞不同时间,采用荧光探针JC-1检测细胞内线粒体膜电位情况,其结果显示低线粒体膜电位的细胞比例明显增加,且呈现时间依赖性关系;(3)Western Blot法检测相关凋亡蛋白显示procaspase-9,procaspase-3蛋白含量明显下降,出现caspase-9,,caspase-3的活性裂解片段,PARP蛋白同样出现裂解,且这些凋亡蛋白含量的改变与凋亡率、低线粒体膜电位的细胞比例高度相关;(4)经10.0μM浓度的4-HPR分别作用NB4细胞0,0.5,1,2,4,6小时,细胞内ROS含量明显升高,且ROS含量的升高明显早于相关凋亡蛋白的变化,进一步的研究证实经抗氧化剂NAC作用,10.0μM的4-HPR对NB4细胞的诱导ROS含量升高以及凋亡作用均呈现浓度依赖性的逆转;(5)Western Blot检测结果显示p-Akt(Ser473),p-GSK3β蛋白含量均明显减少,提示Akt信号通路与4-HPR诱导的NB4细胞凋亡密切相关,此外不同浓度的Akt信号通路激活剂Insulin以及抑制剂LY294002分别与不同浓度的4-HPR共同作用NB4细胞,结果显示Insulin或LY294002均不能改变4-HPR诱导NB4细胞的作用;(6)汞溴红染色结果显示经4-HPR作用后的NB4细胞,其胞内二硫键含量增加,还原性SDS-PAGE检测NB4细胞内Akt1蛋白氧化还原状态的结果显示4-HPR作用后NB4细胞内Akt1蛋白的氧化态含量明显升高,还原态含量明显减少;(7)免疫沉淀、免疫荧光结果显示经4-HPR作用后NB4细胞内Akt1蛋白与HSP90蛋白的相互作用减少,而与PP2A蛋白的结合增强,进一步研究发现,这种蛋白之间的相互作用可被抗氧化剂NAC所逆转。结论:4-HPR刺激NB4细胞产生的ROS可改变Akt1蛋白的氧化还原状态,进而调节Akt蛋白与HSP90、PP2A蛋白的相互作用,从而使Akt1蛋白发生去磷酸化作用。更多还原