青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌(ANTI-8098A)的绿色荧光蛋白基因的转导及其生物学特性变化

【作者】 车建美； 刘波； 张彦； 蓝江林；

【机构】 福建省农业科学院农业生物资源研究所； 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室； 福建农林大学植物保护学院；

【摘要】 对生防菌定殖的追踪和监测对研究生防菌的生防机制至关重要。很久以来,抗生素标记成为人们常用的手段,可是这种方法却不易区别环境中对标记抗生素有同样抗性的土著微生物,而且使用选择平板法并不能明确细菌在根周围小生境的空间分布。标记基因技术的建立与发展,为生防细菌定殖的微生态学研究提供了有效手段。其中绿色荧光蛋白(GFP)因为荧光性能稳定、检测方便以及表达不受受体种属限制等特性,而越来越为人们重视,并被成功地用于研究细菌在植物根部的定殖。ANTI-8098A(蜡状芽孢杆菌,Bacillus cereus),系本实验室从福建省福州市的农田发生青枯病的番茄根系筛选到的一株芽孢杆菌。大肠杆菌DH5α为质粒pCM20的宿主菌,由瑞典农业大学微生物系Janet Jansson教授惠赠,其中带有红霉素(Erysymysin,Em)抗性基因和gfp基因。本实验从含150μg/ml红霉素的LB平板中挑取新鲜培养的1个在荧光显微镜下发绿色荧光的质粒宿主菌DH5α的单菌落,于100ml含150μg/ml红霉素的LB液体培养基中,37℃条件下振荡培养16～18h后,进行质粒提取,质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。ANTI-8098A:pCM20菌株的生物学特性主要包括标记菌株gfp基因表达稳定性的检测,生长曲线的比较和微生物学特性的比较,以及对不同寄主青枯雷尔氏菌的抑菌作用。采用质粒pCM20进行青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,ANTI-8098A)的电击转化,对电击转化条件的优化结果表明,当电击条件为2.5kV,200Ω,25μF时,转化的最佳条件为质粒DNA含量为118ng,感受态细胞浓度为1.14×10~8CFU/ml。转化子ANTI-8098A:pCM20在无红霉素选择压力的M9培养基中,绿色荧光菌体细胞含量比在含有红霉素选择压力的M9培养基中含量低。对其生长曲线的测定结果表明,青枯病生防菌ANTI-8098A的生长速度比ANTI-8098A:pCM20快。不同培养温度和培养转速对ANTI-8098A:pCM20生长的影响较大,当培养温度为35℃时,ANTI-8098A:pCM20的含量为60.0×10~8CFU/ml,当培养转速为250r/min时,ANTI-8098A:pCM20的含菌量为50.33×10~8CFU/ml。青枯病生防菌ANTI8098A:pCM20和ANTI8098A对不同作物分离的青枯雷尔氏菌具有明显的抑制作用,抑菌效果无显著差异。更多还原