麦长管蚜中Cdc42基因的组织定位及相对表达量

【作者】 于文娟； 陈巨莲； 程登发； 孙京瑞；

【机构】 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室；

【摘要】 Cdc42属于小G蛋白质Rho家族中一类结构和功能相对保守的蛋白。已有研究报道Cdc42在果蝇翅脉形成过程中,与翅脉的位置和数量有关。本文应用原位杂交技术和实时荧光定量PCR的方法确定Cdc42基因在麦长管蚜中的组织定位及相对表达量,对麦长管蚜的翅型分化研究奠定基础。首先采用原位杂交技术,对Cdc42在麦长管蚜中的分布进行组织定位,并对有翅和无翅蚜虫中的表达差异进行比较。针对已克隆的麦长管蚜Cdc42的mRNA序列设计特异引物,经地高辛标记制成原位杂交探针,以室内饲养的有翅和无翅麦长管蚜的3龄、4龄、成虫的整虫制作石蜡标本;纵切虫体,切片厚度为7μm,再经原位杂交试验;镜检观察。结果表明在有翅蚜和无翅蚜的头部和腹部均有特异性着色点,头部的着色点集中在两复眼之间,腹部的着色点几乎全集中在伪胚胎;有翅蚜的胸部几乎全部被着色,而无翅蚜的胸部几乎没有特异着色点。说明Cdc42在有翅蚜胸部特异表达,且表达量很高。为进一步明确Cdc42表达量的差异,再运用实时荧光定量PCR技术定量的确定该基因在有翅和无翅麦长管蚜的不同龄期和不同部位的相对表达量。提取有翅和无翅麦长管蚜不同龄期的整虫（含伪胚胎和去除伪胚胎）和各部位（头,胸,腹,伪胚胎）的RNA,定量反转录后进行荧光定量PCR。所得数值用2^-ΔΔct方法（选取有翅蚜成虫整虫为CK,设为1）处理后发现:①在整虫中,Cdc42在二龄的表达量最高（含有伪胚胎）;有翅若蚜（含伪胚胎和去除伪胚胎）的表达量高于成蚜,均高于1,且随着龄期的增长,表达量递减;②含有伪胚胎的整虫中,无翅蚜3龄、4龄、成虫的表达量均低于1,且随着龄期的增长表达量逐渐递增;而在有翅蚜3龄、4龄、成虫的表达量均高于1,且随着龄期的增长表达量逐渐递减;③去除伪胚胎的整虫中,无翅蚜3龄、4龄、成虫的表达量均低于1,且随着龄期的增长表达量逐渐递减;而在有翅蚜3龄、4龄、成虫的表达量仍高于1,且随着龄期的增长表达量逐渐递减;④头部Cdc42表达量在无翅蚜和有翅蚜中随着龄期的增长呈递减趋势,2龄的表达量最高;同龄期的有翅蚜的表达量高于无翅蚜,且均高出1.3倍左右;⑤胸部Cdc42表达量在无翅蚜和有翅蚜中均随着龄期的增长呈递减趋势;无翅蚜表达量均低于1,有翅蚜的表达量达到对照的4倍以上;3龄有翅蚜的表达量比同龄期无翅蚜高7倍,4龄高10倍,成虫高19倍;⑥腹部（含伪胚胎）Cdc42表达量在无翅蚜和有翅蚜中随着龄期的增长呈递增趋势,为对照的4倍左右;经解剖除去伪胚胎后的腹部其表达量均小于1,呈递减趋势,且有翅蚜和无翅蚜腹部的表达量没有差异;⑦伪胚胎Cdc42表达量在无翅蚜和有翅蚜中随龄期的增长呈递增趋势,且相同龄期有翅蚜的表达量均比无翅蚜高1倍;⑧Cdc42在相同龄期的同一部位的表达量,有翅蚜均高于无翅蚜。经上述实验结果可以看出,该基因在有翅蚜中特异表达,且有翅蚜和无翅蚜的胸部表达量差异明显,说明该基因可能与麦长管蚜的翅型分化有关。更多还原