结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的高效表达及在结核菌特异性细胞免疫检测中的应用

【作者】 刘威龙； 周伯平； 张明霞； 杨倩婷； 朱秀云； 王敏； 邓群益； 陈心春；

【机构】 深圳市东湖医院；

【摘要】 目的获得纯化的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6),并对其免疫原性及在结核菌特异性细胞免疫检测中的应用进行评价。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子.将其转化入E.coli B121(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS- PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。纯化的重组蛋白作为抗原进行酶联免疫斑点技术(ELI- SPOT)检测,判断其免疫原性及其在结核杆菌感染细胞免疫监测中应用的可行性。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET- ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别,ESAT-6的ELIS- POT检测结果与阳性对照抗原的免疫原性没有显著性差别,和QuantiFERON-TB-GOLD试剂盒检测结果比较也显示具有显著的特异性和敏感性。结论利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,采用该蛋白可以进行结核菌特异性细胞免疫检测。更多还原