不同辅助因子对CYP1A2和POR体外表达的影响

【作者】 陆慧媛； 马骏； 刘年； 王守林；

【机构】 南京医科大学公共卫生学院毒理学系现代毒理学教育部重点实验室；

【摘要】 目的研究在Baculovirus/Sf9系统中体外表达CYP1A2和POR蛋白时,不同辅助因子Hemin、5-ALA和Fe3 +对表达效率及活性的影响,并尝试CYP1A2和POR的共表达,探寻稳定、高效表达高活性CYP1A2酶和POR的条件。方法使用分子克隆技术构建含有CYP1A2和POR cDNA的重组质粒,并进行PCR和酶切验证;用该质粒转染昆虫细胞Sf9以获得含上述基因的杆状病毒。然后再进一步感染Sf9细胞,表达CYP1A2和POR蛋白。通过加入不同浓度5-ALA、Fe³⁺、Hemin或其组合,观察这些条件对蛋白表达水平和活力的影响。此外,将含CYP1A2或POR基因的杆状病毒按不同比例混合,联合感染Sf9细胞进行共表达。在此基础上,进一步分析5-ALA或（和）Fe³⁺对CYP1A2和POR共表达的影响,寻找最合适的体外表达条件。使用免疫印迹法检测蛋白质的表达情况;使用CO差示光谱法和细胞色素C还原法分别检测CYP1A2和POR的活性。结果同时加入0.1mM 5-ALA和0.1mM Fe³⁺时,CYP1A2蛋白的表达显著提高,相对于单独加入5-ALA、Fe³⁺或Hemin,分别增加了40%、65%和32%;对于POR蛋白,加入了5-ALA和/或Fe³⁺后表达量显著提高,分别相当于不加任何辅助因子时的2.13、1.71和1.86倍,以仅加入5-ALA时表达水平最高;同样的结果也反映在POR的活力上,加入5-ALA和/或Fe³⁺分别提高7.1倍、4.5倍和5.4倍。在Baculovirus/Sf9系统中进行CYP1A2和POR共表达时,当病毒比例为2.5:1或3:1时,无论CYP1A2还是POR,其表达量都显著增加,分别比2:1和4:1时提高约50%,且两者的表达比例较为适当;在CYP1A2:POR病毒比例为2.5:1的表达体系中,加入0.1和0.35mM 5-ALA时,CYP1A2和POR的表达量都显著高于0. 6mM;此外,加入0.1mM Fe³⁺时,蛋白表达也有较高水平;但有趣的是,当联合加入5-ALA和Fe³⁺时,蛋白的表达量反而下降,相关机制有待进一步研究。结论不同辅助因子对CYP450和POR的表达及活性有明显影响。联合加入5- ALA和Fe³⁺可显著增加CYP450的表达和活性;低浓度5- ALA或Fe³⁺、以及CYP1A2和POR病毒比例为2.5:1或3:1时,有利于两者的共表达。更多还原