利用“致死点突变筛选”策略研究AtGSTZ功能位点

【作者】 陈德富； 陈喜文； 刘佳； 杨鹏；

【机构】 南开大学生命科学学院；

【摘要】 酶的结构与功能关系密切,然而绝大多数酶的结构目前并不清楚或不完全清楚,因此酶的结构-功能关系目前了解得很少,成为蛋白质工程和基因工程研究中的一大瓶颈。酶学理论指出,酶的活性通常由被称为活性中心或活性位点的几个特定氨基酸残基所决定,若活性位点的氮基酸残基发生改变,酶的结构可能随之发生改变,进而酶的活性也将随之发生改变。由于点突变不改变读码框架,因此致死点突变可能与活性位点氨基酸残基改变有关。"致死点突变筛选"可帮助我们了解有关酶活性位点信息。本文以拟南芥谷胱甘肽 S-转移酶 Zeta 类 (AtGSTZ)为模式酶,试图通过"致死点突变筛选"策略阐明其功能位点。通过颜色改变的高通量筛选方法,从库容为3000的 EP-PCR 文库中,筛选出了25个失活突变。其中,L11P (L11P)、L11P/I140T、L27P(L27P、L27P)、K30E、L80P/N116S、L147P、L150P、L169R 和 S105R/Q213R 为包含体,无 DCA-DC 活性:W15R(w15R)、C19Y、C19R/S105G、R22H/K83E (R22H/K83E)、P61S、S73P、S109P 和 Q112R 仅保留野性酶1%以下活性,K83E、Q102R 和 L147F 仍分别保留野性酶49.4%、31.6%和52.3%活性。K83E 活性远高于 K83E/R22H,暗示 Arg22可能是 AtGSTZ 重要位点,这与 Thom et al(J.Mol.Biol.2001:308:949～962)报道的 Arg22 可能参与底物结合口袋形成的结论一致。L147P 是包含体,而 L147F 仍保留52.3%活性,暗示 147位疏水性氨基酸对 AtGSTZ 活性的维持是必需的。以人 hGSTZ 的3D 结构为对照,通过同源比对,模拟出 AtGSTZ 的3D 结构(图1),显示 Trp15、Cys19、Arg22、Pro61、Ser73、Ser109 和 Gln112残基位于底物结合口袋附近,Lys83、Gin102和 Leu147残基远离底物结合域。通过结构计算发现,Trp15、Ser109和 Gln112残基与口袋的距离大于6 Å,暗示这些残基与催化活性无直接关系;Cys19、Arg22、Pro61和 Ser73残基与 GSH 结合域非常近,其中 Ser73 羟基的 Oγ与 GSH 结合域仅2.1Å:,暗示该位点与底物 GSH 的结合有关。通过定点诱变发现,S73A 突变仅保留21.6%活性。更多还原