根瘤农杆菌介导aiiA基因对大白菜的遗传转化研究

【作者】 田志宏； 钟燕华； 何勇； 严寒； 许本波； 徐锋； 赵福永； 邱永福； 周燚；

【机构】 长江大学生命科学学院； 长江大学农学院；

【摘要】 大白菜亦称结球白菜,是十字花科芸薹属栽培作物。由于其产量高、品质好、营养价值高,并且耐贮藏,是我国秋冬季节重要的蔬菜之一。但是软腐病对大白菜危害很大,在软腐病盛行时期,严重时可造成个别地块减产50%以上,甚至是绝产,若在窖内储藏则可造成全窖腐烂。不仅严重影响了大白菜的产量和农民的收入,而且还影响了城市蔬菜的供应。Erwinia carotovora 是大白菜软腐病的致病菌,其致病过程是受群体感应调节系统调控的,并且该系统的信号分子是 N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)。研究者从苏云金芽孢杆菌中克隆了一个 aiiA 基因,该基因能够水解 AHL,使其失去作为信号分子的能力,从而阻断 Erwinia carotovora 的致病过程。本研究旨在通过根瘤农杆菌遗传转化技术将 aiiA 基因导入大白菜中,获得对软腐病有较高耐受力的大白菜新材料。以大白菜‘鲁白六号’5d 苗龄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,采用 L25(56)正交设计试验探讨了4种植物生长调节剂(α-NAA、6-BA、TDZ、ABA) 和 AgNO3对不同外植体不定芽诱导的影响。结果表明:α-NAA 对子叶不定芽的诱导有一定的影响;确定以 MS+1.0mg/L α-NAA+3.0mg/L TDZ+5.0mg/L AgNO3为最佳子叶不定芽诱导培养基,不定芽诱导率最高为68.87%:MS+0.8mg/L α-NAA+5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+7.0mg/L AgNO3为最佳下胚轴不定芽诱导培养基,不定芽诱导率最高为0.49%。同样以‘鲁白六号’5d 苗龄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,采用 L25(56)正交设计试验探讨了 4种植物生长调节剂和 AgNO3对不同外植体愈伤组织诱导的影响。结果表明:α-NAA 对子叶愈伤组织诱导具有重要的作用;确定以 MS+1.0mg/L α-NAA+1.0mg/L 6-BA+3.0mg/L TDZ+0.5mg/L ABA+10.0mg/L AgNO3为最佳子叶愈伤组织诱导培养基,出愈率最高为99.15%; MS+0.8mg/L α-NAA+2.0mg/L 6-BA 为最佳下胚轴愈伤组织诱导培养基,出愈率最高为 99.54%。以工程农杆菌 Hn1301(内含 PU1301-aiiA 质粒)作为侵染菌株,采用 L9(34)正交设计试验对影响根瘤农杆菌转化效率的3个主要因素(菌液浓度 OD600、侵染时间和共培养时间) 进行优化,建立了较完整的以子叶为外植体的‘鲁白六号’遗传转化体系,即应该在菌液浓度 OD600为0.3～0.5、侵染时间为10min、共培养2d 的条件下进行遗传转化。共培养基为 MS+1.0mg/L α-NAA+3.0mg/L TDZ+5.0mg/L AgNO3+0.01962g/L AS,选择及脱菌培养基为 MS+1.0mg/L α-NAA+3.0mg/L TDZ+5.0mg/L AgNO3+400mg/L Carb+1.0 mg/L Hyg。结果再生出8株潮霉素抗性苗,经 PCR 鉴定和 gus 基因检测初步证明 aiiA 基因已经导入到大白菜‘鲁白六号’中。更多还原