水稻基腐病细菌致病毒素研究

【作者】 刘琼光； 张静一； 王玉涛； 罗建军； 王振中； 张炼辉；

【机构】 华南农业大学资源环境学院植物病理系；

【摘要】 由菊欧氏杆菌玉米致病变种（Erwinia chrysanthemi pv.zeae）引起的水稻基腐病,是近二十年来水稻上重要的细菌病害之一,在东南亚许多国家都有发生,成为水稻高产稳产的严重障碍。水稻基腐细菌毒素迄今未见报道。毒素是病原微生物重要的致病因子之一,毒素的分离纯化是研究病菌毒素功能和作用的前提和基础。本研究首次建立了水稻基腐细菌毒素的分离纯化方法,通过3种不同的层析柱的多次层析分离及对水稻幼苗的生物活性跟踪测定,分离获得了水稻基腐细菌毒素的一个成分T₃,采用化学及生物化学方法,研究毒素的性质及生物学作用。结果表明,该毒素成分为黄色固体,溶于甲醇、正丁醇、水和甲酸:不溶于三氯甲烷、乙酸乙酯;微溶于丙酮,是非糖类和非蛋白质类物质,对紫外线敏感,在酸性条件和空气中易分解。毒素具有抑制水稻生根、使水稻秧苗萎蔫和对烟草细胞坏死的作用。高浓度毒素抑制水稻、玉米、番茄和烟草种子萌发,低浓度毒素则具有促进根、芽生长的作用。毒素对来自5个属的10种植物病原细菌具有抑菌活性,同时具有诱导水稻PAL和POD活性,且对抗病品种128的POD和PAL诱导活性均高于感病品种特籼13,毒素对叶片POD和PAL活性的诱导均早于对根的诱导。用病菌毒素注射烟草叶片后,导致烟草细胞中O₂和NO的大量增加。CAT、SOD、POD和PAL等酶活性总体呈上升水平。电泳检测烟草DNA断裂成小片断且出现明显的弥散,没有细胞程序性死亡（PCD）的DNA梯特征。电镜观察表明,用毒素处理4 h后,烟草叶肉细胞的细胞膜从细胞壁上开始脱落,出现质壁分离现象,叶绿体的基质片层排列紊乱,叶绿体基粒结构变形,细胞膜和叶绿体膜周围出现电子密集的沉积物,并且细胞膜内陷;毒素处理8 h后,叶绿体变形,叶绿体基质片层大部分消解,基粒结构消失叶绿体外膜和内膜剥离,细胞内很多细胞器消解,质壁分离和细胞膜内陷程度加重:毒素处理48 h后,细胞内含物完全消解,细胞膜消失,细胞壁皱缩变形,叶绿体片层结构完全消解,叶绿体膜断裂,叶绿体内只剩下淀粉颗粒。利用化学诱变剂和Tn5插入突变的方法,获得了不产生毒素的系列突变菌株,验证了病菌对水稻根的抑制是由于毒素的作用。毒素突变体,对水稻种子萌发生根和幼苗的萎蔫均无作用,接种水稻没有致病力。毒素突变体的果胶裂解酶、蛋白酶和果胶甲基酯酶的活性均低于野生菌株。进一步通过浸根接种水稻幼苗,2周后观察,接种野生菌的水稻表现症状,植株生长受到抑制,而接种毒素突变体水稻不表现症状,水稻生长不受影响。半定量PCR结果发现,水稻植株体内野生菌株细菌数量明显高于毒素突变体细菌数量,说明,毒素突变体能在水稻体内定殖,但不引起植物发病,表明,毒素在病菌致病性中起重要作用。一些植物病原细菌的质粒决定病菌的致病性和寄主特异性,决定毒素、激素的产生以及对药剂的抗性。毒素的遗传决定因子,有些是由质粒编码,如冠毒素、丁香菌素、菜豆毒素和烟毒素通常位于细菌的质粒上。本研究通过化学方法,获得基腐细菌去除质粒的突变体,生物活性测定结果表明,野生菌株及其质粒突变体均能产生毒素,认为,水稻基腐病菌毒素合成由染色体基因编碉,与质粒无关。从260条随机引物中,筛选到引物K10,能从化学诱变的毒素突变体中扩增出2139bp大小的DNA特异片段,将其克隆测序,设计特异引物,在突变体中获得了与毒素产生相关的SCAR分子标记。该片段有5个ORF,其中两个ORF分别编码NADH.黄素还原酶和N-乙酰转移酶,另外两个不完整的ORF编码的蛋白分别与Pseudomonas aerginosa（ZP00136947）和Yersinia Pestis（ZP01177873）的抗菌素代谢转运蛋白通透酶（DMT）具有66%和46%的同源率。从基腐病细菌Tn5插入的毒素突变中,克隆了一个双组分系统一致病性综合调节因子ExpA基因和感受蛋白ExpS基因,致病性测定结果表明,ExpA调控病原细菌毒素的产生、胞外酶活性、对水稻的致病性和烟草的HR。关于基腐病细菌产生毒素的其它相关基因和致病因子信号调控机理正在研究中。本研究将为进一步阐明水稻基腐病菌的致病机理,明确毒素与其它致病因子的关系,了解控制病菌毒素产生的有关基因,提供重要的研究材料和参考价值,同时对制定水稻基腐病的有效防治措施也将具有重要的实际意义。更多还原