糖蛋白中微量N，O-糖链的释放和结构分析

【作者】 焦广玲； 于广利； 王培培； 宋乐天； 赵峡； 张真庆； 任素梅；

【机构】 中国海洋大学医药学院糖科学与糖工程实验室；

【摘要】 目的以两种标准糖蛋白(Mucin,Fetuin)为原料,探索微量N,O-糖链的释放、分离和结构研究的方法。方法使用饱和氨水释放Mucin中的O-糖链,使用PNGase F酶法释放Fetuin中的N-糖链,采用Superdex peptide(XK1/30)柱分离纯化N,O-糖链;纯化的糖链可以采用高效离子色谱(Dionex ICS-3000)直接分析或者采用还原氨化的方法对糖链进行荧光标记;标记的糖链用高效液相色谱分离(GlycoSep N,4×250 cm)制备,各种糖链采用质谱(ESI-MS以及MALDI-TOF-MS)确定结构。结果饱和氨水降解不仅可释放O-糖链,也能释放N-糖链,但N-糖链的释放率明显低于PNGaseF酶法。释放的糖链分别采用2-AB和□-奈胺标记,比较了二种标记方法的有缺点,发现□-奈胺标记方法简便得率高,标记样品4℃下3个月内稳定。运用氨解法从Mucin中分离到了四条O-糖链,酶解法从Fetuin中释放分离到了三条N-糖链,经□-奈胺标记分离后并用ESI-MS分析确定了他们的结构。运用建立的方法从事了人乳腺癌组织和小鼠乳腺癌细胞中O-糖链的分析,表明该方法的可行性。结论采用氨解的方法可以从糖蛋白中释放N,O-糖链,所得糖链可以进行离子色谱以及荧光标记后进行高效液相色谱Mapping分析以及质谱结构分析。该方法不仅用于纯品糖蛋白中糖链分析,而且适合与细胞和组织中混和糖蛋白中微量糖链的释放和分析。更多还原