人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的构建及其对肿瘤细胞生长的影响

【作者】 崔秀云； 李坤； 田余祥； 樊建惠； 赵宝昌；

【机构】 大连医科大学生物化学及分子生物学教研室；

【摘要】 任何糖核酸酶抑制因子（Human ribonuclease inhibitor,hRI）是体内重要的蛋白质,在哺乳动物细胞质内广泛存在．hRI 分子量约为50Kda,基因定位15p^15．5,一级结构富含亮氨酸和大量还原型半胱氨酸,空间结构由富含亮氨酸残基重复区（Leucin-rich reapeat,LRR）的α/β螺旋折叠结构重复多次形成的弯曲的马蹄形结构．国内外研究发现,在正常细胞内,hRI 通过作为 RNase A 抑制剂(Ki=4．0×10^-14 M),从而调控细胞内 RNA 的水平；hRI 还可以作为血管生长因子（Angiogenin,Ang）抑制剂(Ki=7．1×10^-16 M)而抑制肿瘤血管形成、浸润及转移等作用；hRI 还具有抗机体氧化损伤功能．综合国内外的研究, 本课题组推测人核糖核酸酶抑制因子基因可能为抑癌基因的候选基因．为了证明 hRI 基因是否是抑癌基因,我们构建了针对 hri 基因的 siRNA 表达载体 pKD-dsRI,及该 siRNA 的稳定表达载体 pLNCX-pKD-dsRI．同时构建了过表达 hri 的携带有绿色荧光蛋白的表达载体 （pEGFP-C₁-hri）及逆转录病毒表达载体（pLNCX-EGFP-C1-hri）．将这些重组质粒分别转染到小鼠黑色素瘤细胞 B16细胞中,用细胞荧光定位法检测共转染的报告基因-绿色荧光蛋白荧光表达程度．结果表明,检测到干扰效果可达80%以上．用 RT-PCR 半定量分析显示,Westen-blotting 分析表明,hRI 表达明显下调．用载体 pLNCX-pKD-dsRI 对 B16细胞中的 hRI 基因表达干扰后,MTT 检测细胞生长增殖能力,结果发现细胞生长能力显著增加,增殖率是对照组 B16细胞的120%（P<0．05）；流式细胞仪检测细胞周期时相,结果显示：细胞周期发生明显改变,S 期增加52．32%,G2-M 期降低了53．54%．此研究初步表明人核糖核酸酶抑制因子可能属于一种抑癌基因．更多还原