小鼠NR4A1基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

【作者】 薛凯； 李梅； 刁飞扬； 凌静； 崔毓桂； 刘嘉茵*；

【机构】 南京医科大学第一附属医院临床生殖医学中心；

【摘要】 目的:为研究NR4A1基因的生物学功能及其在相关疾病中的作用,尤其在多囊卵巢综合症(PCOS)病理生理机制的关键作用,本文构建了表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的重组腺病毒载体。方法:根据siRNA靶序列的设计要求设计并合成2条互补的64bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。Pme I酶切pShuttle-H1-siRNA,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组。Pac I酶切线性化重组质粒pAdeasy-H1-siRNA后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。Western blot检测NR4A1基因的表达。结果:穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切与测序证实构建成功,进一步构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体,重组腺病毒AdH1-siRNA/NR4A1感染MLTC-1细胞后显著抑制目的蛋白表达(70%~90%)。结论:成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA/NR4A1,并在细胞中验证其对NR4A1基因表达的影响,为进一步研究NR4A1基因在相关疾病中的作用奠定了基础。更多还原