移植成人骨髓间质干细胞在脑梗死模型鼠的分化及功能恢复研究

【作者】 何国雄； 李飞； 李海标； 梁志忠； 潘志信； 利玉欢； 黄锦桃；

【机构】 广东省佛山市南海人民医院神经内科； 中山大学中山医学院组胚教研室；

【摘要】 目的:探讨成人骨髓间质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)在脑梗死模型大鼠脑内的迁移和分化及其对大鼠的运动功能的影响?方法:取来源于胸外科手术丢弃的成人肋骨,无菌条件下冲洗出骨髓,将骨髓混悬液经 Ficoll-Paque分离液,离心30 min,收集单核细胞层。按1×109cells／L密度接种,37℃、5％CO2、饱和湿度下培养、传代。取第6代hMNCs用于移植,移植前以Hoeschst33342标记。选用体重300-400gSD大鼠建立左侧大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,假手术组不闭塞大脑中动脉。实验动物分组:脑梗死组将模型制作成功的40只MCAO大鼠作梗死组,各20只分别在移植术后第2和4周处死,取大脑制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察移植细胞的存活与迁移情况,并用荧光双标进行免疫组织化学检测观察分化情况。假手术对照组20只大鼠,分别与治疗组在相同时点处死,取大脑制作冰冻切片,亦进行荧光观察和免疫组织化学染色。移植所有操作均在无菌条件下进行,取MCAO手术7d后的大鼠,将hMNCs植入脑梗死的周围。缓慢注入浓度为1011／L hMNCs 5μL,对照治疗组则注入无细胞的DMEM。各组大鼠在移植术前及移植后第2、4周进行神经功能检查,采用改良神经功能缺损量表(MNSS)测定大鼠神经功能。同时进行间接免疫荧光实验,检测鼠抗人神经元烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、鼠抗人神经丝蛋白单抗 (neurofilament,NF)。结果:1．经过贴壁筛选获得的纯化hMNCs,用流式细胞仪检测hMNCs的表面标记显示细胞均一性好, 纯度达95％以上,通过对表面标记的检测说明hMNCs为非造血类细胞。2．hMNCs在大鼠脑内存活、迁移和分化植入大鼠脑内的hMNCs随着植入时间的延长,其存活数量逐渐减少。但hMNCs的迁移范围越来越大,多位于梗塞灶与正常大脑组织交界处,并有部分迁移到病灶内。移植后hMNCs在模型大鼠脑内的免疫荧光检测移植后部分hMNCs表达神经元、神经胶质细胞的表面标志物。而对照组未进行hMNCs的输注,冰冻切片上未见人源性神经元抗原的表达。3．大鼠神经功能恢复术前MNSS评分,两组间无显著差异,MACO术后,两组大鼠均出现严重的神经功能缺损,但随着时间的延长,两组大鼠神经功能均有所改善,移植组大鼠从移植后第2周开始,神经功能明显好转,与移植前及对照组相比差异有非常显著性意义 (P<0．01),随着时间延长神经功能改善更为明显(P<0．01)。结论:hMNCs可在大鼠脑内迁移并分化为神经元及星形胶质细胞,能明显促进神经功能恢复。更多还原