葡萄病毒A的致病性研究

【作者】 周宗山； M.Dell’Orco； P.Saldarelli； A.Castellano； C.Turturo； A.Minafra； G.P.Martelli；

【机构】 中国农业科学院果树研究所； 意大利巴里大学植物保护和微生物应用系； 意大利CNR植物病毒研究所巴里分部；

【摘要】 葡萄病毒 A(GVA)是葡萄病毒属(Vitivirus)的代表成员,引起葡萄克勃茎沟病(Kobe Stem Grooving,KSG),是造成重要经济损失的葡萄主要病毒之一。GVA 的核酸为单链正义 RNA[(+)ssRNA],包含5个开放阅读框(ORFs),其中 ORF1、ORF3和 ORF4分别编码 RdRp、 MP 和 CP 蛋白,但编码19kDa 和10kDa 蛋白的 ORF2和 ORF5的功能长期内没有得到验证。2003 年以色列的实验人员完成 GVA 的完整序列克隆并构建了包含 GVA 全序列的 pGVA 质粒,通过对 pGVA 质粒中 GVA 的5个开放阅读框分别诱导变异并对 N．benthamiana 接种研究发现,ORF5的变异没有改变侵染位点细胞或原生质体中 GVA 其它 ORFs 的扩增,但却阻断了 GVA 在 N．benthamiana 烟草上的系统侵染性并导致症状的缺失,据此推断 ORF5应为 GVA 的致病因子。为了确证 GVA ORF5的致病性,我们采用让 ORF5直接表达而非变异的策略进行了研究。研究中将 ORF5完整克隆到 PVX 质粒 pP2C2S 以构建质粒 PVX-ORF5,转录后获得的 PVX-ORF5 mRNA 通过摩擦接种转到 N．benthamiana 烟草幼嫩叶片,在 PVX CP 基因调控子的调控下 ORF5得到充分表达,并引起与 GVA 侵染相同的症状。在接种后6～8天时,接种叶片出现坏死斑点,系统症状随后发展很快,稍老叶片表现为脉黄,与 PVX 侵染的植株相比植株明显矮化,幼嫩叶片皱缩并在极短的时间内出现严重坏死,有时甚至出现在叶柄和茎上,叶柄和茎的坏死状况从来没有出现在 GVA 侵染的植株上,这可能是由于 PVX 的强烈表达所导致。反观 PVX 侵染的植株,摩擦接种叶片只出现黄化斑点,系统症状仅为严重的花叶,植株并不矮化。通过变异诱导在 ORF5序列的起始阶段构建终止密码子,获得了非翻译性的 PVX-ORF5mut,它的侵染只引起和 PVX 侵染一样的症状。通过上述研究确证了 GVA 病毒的 ORF5为该病毒的致病因子,其致病性是该因子编码的 p10蛋白直接作用的结果,与 GVA 其他因子的扩增没有直接关系。更多还原