简便快速制备外分泌抗肿瘤效应因子腺病毒的新方法

【作者】 李金萍； 张光谋； 胡颖； 柯杨； 林仲翔； 张志谦；

【机构】 北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院北京市肿瘤防治研究所细胞生物室；

【摘要】 目的:腺病毒作为一种高效感染各种细胞的工具,在基因治疗和基因导入研究中具有重要的应用价值,然而过去常用的制备方法复杂繁琐、耗时长、制备效率低,其应用受到很大的限制。另外许多具抗肿瘤效应的生物活性因子其作用的靶位点常位于细胞外部,因此在基因治疗中需将这些因子表达并分泌到细胞外部。本研究利用一种新的腺病毒制备的细菌重组体系,以生长激素基因的信号肽为分泌信号,介导内皮细胞粘附因子α_ηβ₃拮抗剂 PEX 表达分泌的体系。方法:利用 DNA 重组技术构建 CMV 启动子启动、含有鼠生长激素基因前导信号肽序列和 PEX 基因融合基因的 PAdTrack-CMV 质粒载体（含 GFP 示踪标记分子）,经 EcoR1 内切酶线性化后,与环状的 PAdEasy-1质粒共转化 BJ5183大肠杆菌菌株,抗生素筛选同源重组后的菌落,酶切鉴定后,LipofectAmine 转染 L293包装细胞,进行腺病毒的包装、扩增、滴度测定;利用该腺病毒感染 BGC-823细胞后进行免疫荧光染色。结果:基因转染后3天的培养上清感染 L293细胞, 荧光显微镜下即可见到大量 GFP 阳性细胞,提示已有大量具感染力的腺病毒包装形成,经体外反复感染1293细胞,扩增2-3轮后,即可得到足够量的病毒颗粒;该病毒颗粒感染胃腺癌 BGC-823细胞后, 可见分泌特性蛋白的表达。结论:该方法是一种简便、快速制备腺病毒的新技术,整个过程从 DNA 重组到包装扩增到实验可用的滴度可在1-2个月内完成,为其大范围的应用提供了可靠的技术基础。所构建的外分泌表达的腺病毒载体为基因治疗提供了一种新的工具, 利用其分泌表达 PEX 以拮抗肿瘤的效应正在研究之中。更多还原