TUNEL改良方法在大肠癌组织细胞凋亡检测中的应用

【作者】 张进华； 陆药丹； 邓敏； 杨建芳； 熊平霞；

【机构】 南方医科大学病理教研室； 南方医科大学南方医院病理科；

【摘要】 细胞凋亡是细胞的程序性死亡,近年来,凋亡检测技术有了很大的发展。特别是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术,在组织原位同时显示凋亡细胞形态和分布,且具有简便、快捷、敏感、无辐射等优点,因而得到了广泛应用。我们在 TUNEL的技术方法的基础上加以改良,应用于检测大肠癌组织细胞凋亡,得到较好的效果。实验步骤(1)切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1％火棉胶封片,PBS漂洗;(2)3％H2O2阻断 PBS漂洗;(3)组织切片浸泡于盛有1．0mol／L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W, 辐射时间15min的条件下进行组织处理。冷却至室温。(4)放在通透液(0．1％Triton-100溶于0．1％枸橼酸钠溶液)中室温20分钟,PBS漂洗;(5) 滴加50μ1 TdT反应液37℃1h,PBS漂洗;(6) 滴加50μ1 biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗;(7)滴加50μ1链霉菌标记辣根过氧化物酶液 37℃孵育30分钟,(8)PBS漂洗,DAB-H2O2显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。阳性对照dTd反应前用20μg／ml蛋白酶K处理切片。阴性对照用PBS代替dTd反应液。结果改良的方法:凋亡细胞核呈棕色固缩,有白边集或碎裂, 细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性。计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率。我们经过改良在 dTd反应液前省去蛋白酶K的预处理,取而代之用微波处理组织切片,并用通透液作用切片,获得了良好的结果。更多还原