系膜细胞的饰胶蛋白聚糖泛素化调节的研究

【作者】 吴慧娟； 王小刚； 刘晔； 赵仲华； 冯秀艳； 王慧君； 张志刚；

【机构】 复旦大学上海医学院病理系；

【摘要】 目的观察肾系膜细胞饰胶蛋白聚糖(DCN)受泛素-蛋白酶体系统调节降解的作用及其意义。方法 pcDNA3．1-DCN质粒纯化,酶切鉴定,采用脂质体介导法将该质粒稳定转染系膜细胞, G418筛选阳性克隆,Western blot和免疫荧光法对阳性克隆进行鉴定;采用免疫共沉淀法检测正常系膜细胞和转染DCN的系膜细胞中DCN与泛素的结合情况;使用蛋白酶体阻断剂MG132(2．5μM)处理系膜细胞,培养6h和12h后收取蛋白,检测DCN与泛素的结合情况。结果经测序和双酶切证实 pcDNA3．1-DCN质粒正确;Western blot和免疫荧光法筛选鉴定,得到4株过表达DCN的阳性克隆D-1, D-2,D-3,D-4。免疫共沉淀法结果显示系膜细胞中DCN与泛素结合,过表达DCN的系膜细胞中泛素化的DCN表达水平升高,采用MG132处理后的系膜细胞中泛素化的DCN表达水平也升高。结论系膜细胞中DCN的降解通过泛素-蛋白酶体系统调节,MG132能阻断DCN降解而使系膜细胞中泛素化的DCN表达水平升高。更多还原