【作者】 苟钟勇； 王劼； 罗何峰； 彭健；

【Author】 GOU Zhongyong, WANG Jie, LUO Hefeng, PENG Jian (College of Animal Science and Technology, Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070, China)

【机构】 华中农业大学动物科技学院；

【摘要】 <正>胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是一种典型的脑肠肽,可以通过中枢和外周途径共同调节采食,是一种重要的调节动物采食量的食欲饱感因子。通过注射CCK抗原直接免疫动物可以有效调节动物采食,常用的CCK抗原是通过化学合成的小分子半抗原CCK-8与大分子物质交联制成抗原。然而,化学合成的CCK-8价格昂贵,仅适用于实验室抗原制备。利用基因工程技术在大肠杆菌中表达CCK可以降低成本,容易实现产业化生产;同时构建CCK-33的多串体可以增加蛋白质的分子量,从而增强其抗原性。本试验根据NCBI上已发表的猪CCK-33基因的碱基序列,并参照大肠杆菌密码子使用数据库(Codon usage database,网址:／／www．kazusa．or．jp／codon),设计合成了大肠杆菌表达系统偏爱的猪CCK．33基因序列。将合成的CCK-33基因通过PCR扩增、酶切、连接、转化克隆至pRSET B质粒上,分别获得不带终止子和带终止子CCK-33基因单体pRSETB-1CCK的重组质粒。在此基础上利用限制性内切酶BamH I和 BglII是同尾酶的原理,经多次克隆最终成功构建了带终止子的pRSET B-3CCK、pRSET B-5CCK、pRSET B-7CCK、pRSET B-9CCK重组质粒。对构建好的CCK-33多串联体测序,测序结果与理论设计的完全吻合。将经过测序鉴定为阳性克隆的CCK-33七、九串联体转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中,用IPTG 诱导表达,表达出的七、九串联体目的蛋白分别占菌体总蛋白的28％和35．6％。用CCK-8(购自Sigma 公司)和牛血清白蛋白交联后作为抗原免疫蛋鸡,将获得的IgY作为一抗,用辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY作为二抗,Western-blot检测表达产物发现:7CCK、9CCK重组蛋白都能与相应的CCK抗体特异性结合。上述试验结果说明,7CCK、9CCK重具有较好的免疫原性。更多还原