稳定整合pTet-on载体小鼠胚胎干细胞株的建立

【作者】 张梅英； 李华； 董婉维； 杨葳； 秦英； 汪瑛； 周生来； 于洋； 王惟； 王太一； 王禄增；

【机构】 中国医科大学实验动物部；

【摘要】 目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PCR和southern blot方法进行DNA整合鉴定,并用瞬时转染荧光素酶报告基因(pTRE-Luc) 对筛选的Tet-on阳性克隆株的功能进行鉴定。结果经400ug／mL的G418压力筛选后,获得了11个细胞克隆株,特异性核苷酸引物检测细胞基因组DNA,有9个ES-D3细胞株可以扩增出相应的核苷酸片段,部分Tet-on阳性ES-D3株Southern blot 鉴定结果表明Tet-on基因片段已整合入ES-D3细胞基因组DNA,荧光素酶报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为21．31 的ES-D3细胞株,且Tet-on基因阳性ES-D3细胞的形态和生长速度与正常ES-D3细胞没有差异。结论通过电穿孔转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为21．31的高表达ES-D3细胞株,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中转染和诱导表达打下了基础。更多还原