人PDE5A1反义cDNA重组腺病毒载体的构建

【作者】 赵永平； 王晓峰； 白文俊； 闫征；

【机构】 北京大学人民医院泌尿外科；

【摘要】 <正> 目的:构建人PDE5A1启动子反义cDNA重组腺病毒载体,为进一步研究应用腺病毒载体介导的反义核酸进行阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗奠定基础。方法:①反义cDNA序列设计:根据基因库(GeneBank,编号AB00161S01,AF155195)PDE5A1基因序列图谱中确定具有完整PDE5A1启动子活性的139 bp基因片段。此基因片段包括PDE5A1特异的第一外显子基因片段(78 bps)。经过计算机处理设计此基因片段的反义cDNA链,并分别在5′端和3′端加内切酶BamH Ⅰ及Not Ⅰ;②Entry clone;③表达载体的建立:将含有attL-Entry clone和含有attR-的pAd/CMV/V5-DEST载体加入LR反应混合物及E.coli(DB3.1)中进行提取质粒,用全自动分光更多还原