分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及其表达

【作者】 戴五星； 陈智浩； 高红； 黄海浪； 梁靓； 皇甫永穆；

【机构】 华中科技大学同济医学院生物化学与分子主物学系；

【摘要】 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCG-SP-HSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明所克隆的两个DNA片段与报道结果完全一致,重组体连接方向正确,阅读框准确无误。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分支杆菌(Mycobacterial smegmatis,MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到重组耻垢分支杆菌表达的65KD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分支杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Western-blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。更多还原