【作者】 郭永超；

【导师】 罗文鸿；

【作者基本信息】 汕头大学 ， 生物化学与分子生物学， 2006， 硕士

【摘要】 “马兜铃酸肾病”(Aristolochic Acid Nephropathy, AAN)是近年来在国际上引起广泛关注的一类由中草药的毒副作用导致肾脏损伤的病症，对于其确切的致病机制现在尚无定论。由于马兜铃酸类化合物在体内代谢比较复杂，代谢产物又难以收集，给这类化合物代谢物的毒理学研究造成了很大的障碍。本研究选用丝状真菌短刺小克银汉霉菌(Cunninghamella blakesleana AS3.910)通过微生物转化对这类化合物的主要毒性成分马兜铃酸A和B进行了代谢转化研究。目的在于从微生物代谢的角度探索该菌株对马兜铃酸的转化能力以及探索和哺乳动物(或人)体内药物代谢相比，代谢物的异同点；同时制备一定量有意义的代谢物纯品作为人体药物代谢研究的对照品来辅助研究这类化合物的毒性机理。通过转化在得到了和哺乳动物体内代谢相同的一个目标化合物后，本研究进一步做了母体化合物和代谢物三种马兜铃酸化合物对HK-2细胞毒性的比较。 主要的内容和方法： 一、微生物转化法代谢马兜铃酸A、B，选取小克银汉霉菌属的菌株短刺小克银汉霉菌作为转化菌株，通过菌株的培养，改进种子培养物的接种方法，利用富含菌株孢子的无菌水代替接种环接种，得到了生长旺盛的种子培养物，初步建立转化反应体系。 二、通过对反应体系中各个单因素条件的分析进一步对反应体系进行了优化，得到了一个成熟、适宜、稳定的转化反应系统。 三、用分析型高效液相色谱(HPLC)分析检测转化后反应体系中所存在的化合物成分，利用制备型高效液相色谱对反应体系中的转化产物进行分离和制备。 四、用质谱(mass spectrum)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance)对转化产物的化学结构进行分析鉴定。把得到的产物结构和已见报道的哺乳动物体内代谢产物进行比较，并把有意义的代谢产物进行规模化的制备。 五、马兜铃酸A(AAⅠ)、马兜铃酸B(AAⅡ)和代谢产物(AAIa)三种化合物分别作用于肾小管上皮细胞(renal proximal tubular epithelial cell)HK-2后观察其生长状态的变化。 七、比较分析三种化合物在不同浓度点和不同时间点对HK-2细胞进行孵育后，对细胞活力的影响(药物剂量浓度为：0、5、10、15、20、30、40、60、80更多还原

【Abstract】 It has been reported that Aristolochic acid can cause kidney injury and even induce renal failure. However its mechanism has not been identified, because the metabolism of Aristolochia compounds in body is very complicated and its metabolite is very difficult to be collected. So we established microbial transformation system of Aristolochia compounds by Cunninghamella blakesleana（AS3.910）. Then, the metabolite was isolated and purified for its structure identification and toxicology experiment.We did the comparison of Aristolochic A,B and metabolite’s cytotoxicity on HK-2 cell.Procedures and methods:1. Cultured Cunninghamella blakesleana AS3.910 and established the transformation reaction system.2. Optimized the transformation system by analyzing the multi-factors’ influence to transformation reaction.3.Detected and obtained the metabolite by high performance liquid chromatography.4. Identified the chemical structure of the metabolite by mass spectra and nuclear magnetic resonance.5. Observed the morphological changes of HK-2 cell that exposed to AA Ⅰ,AAⅡ or AAⅠa.6. The inhibition rate of cell growth was determined by MTT assay after treatment with three aristolochia compounds(concentration points: 0,5,10,15, 20, 30,40, 60, 80μg.ml^-1, time points: 12, 24, 36,48h).7. Observed the expression of α-smooth muscle actin by immunohistochemistry.8. Analyzed cell cycle and apoptosis rate of HK-2 cell exposed to three Aristolochia compounds by flow cytometry.更多还原