shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响

【摘要】 目的构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶。方法构建HIF-2α shRNA真核表达载体质粒, shRNA测序鉴定。150 umol/L氯化钴(Co Cl2)模拟细胞低氧环境。设对照组(空白、阴性)和实验组。空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2α shRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组。采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况。结果 DNA测序证实重组质粒构建成功, shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2α mRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2α mRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显。结论低氧环境下,HIF-2α mRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达。干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达。该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础。更多还原