【作者】 于莹；

【导师】 郝东云；

【作者基本信息】 吉林大学 ， 生物化学与分子生物学， 2011， 博士

【摘要】 全世界约有9.5亿公顷的盐碱地,我国盐碱地约9900万公顷,其中盐碱化耕地约800万公顷,其余的盐碱地均未得到有效治理与开发,这是一项非常宝贵的土地资源。随着人口的增加,粮食需求也有所增加,但是可利用耕地面积却逐年减少,因此开发和利用盐碱地受到人们的广泛关注。培育耐盐碱农作物被认为是开发和利用盐碱地最有效的方法之一,随着分子生物学与现代生物技术的发展,使得人们可以从分子水平深入认识和了解植物与盐碱胁迫之间的关系,并且为改良农作物耐盐碱能力开辟新的途径。通过生物技术的方法不仅可以培育出耐盐碱作物的新品种,还可以将一些本身具有优质、高产性状的农作物品种加以改良,赋予其耐盐碱的新特性。羊草(Leymus chinensis)是禾本科赖草属多年生草本植物,具有适应性广、耐盐碱、耐干旱等多种优良性状。因此,羊草可以作为挖掘耐盐碱功能基因和探究植物耐盐碱分子机制的首选材料。本研究利用羊草的EST文库和RACE技术克隆得到了三个与耐盐碱相关的功能基因,包括几丁质酶基因、硫氧还蛋白过氧化物酶基因和液泡H+-ATPase c亚基基因,分别命名为LcChi2, LcTpxll和LVAP1,并在NCBl上申请注册了登录号(GQ397277、GQ397275和GQ397276)。LcChi2基因的开放读码框含有771个碱基,编码256个氨基酸,分子量约为27.4 kDa,具有几丁质酶保守结构域,属于几丁质酶19家族Ⅱ类几丁质酶。在N端有一个信号肽和一个跨膜结构域,属于亲水性蛋白,定位于细胞间隙。LcChi2基因与小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oryza sativa)的几丁质酶基因高度同源,氨基酸序列相似性分别为96%、96%、94%和83%。利用半定量RT-PCR的方法分析了LcChi2基因在胁迫条件下的表达情况,结果表明该基因在400 mmol/L NaCl、100 mmol/L Na2CO3和20% PEG的胁迫下表达上调,说明该基因可能与羊草耐盐碱和干旱胁迫有关。为了进一步研究该基因的功能,将LcChi2基因通过LiAc法转入酿酒酵母INVSc1中。酵母胁迫实验表明,在10 mmol/L Na2CO3、1.6 mol/L NaCl、1.5 mol/L山梨醇和10 mmol/L ZnSO4的肋、迫下,转基因酵母的生长好于对照,说明LcChi2基因可以提高转基因酵母的耐盐碱和干旱胁迫的能力。同时,将LcChi2基因通过农杆菌介导法转化模式植物烟草中。转基因烟草抗病性实验表明,LcChi2基因可以提高转基因烟草抗细菌病害和真菌病害的功能。转基因烟草萌发期胁迫实验表明,在3 mmol/L Na2CO3.200 mmol/L NaCI和500mmol/L山梨醇的胁迫下,转基因烟草的长势好于野生型。转基因烟草苗期的耐盐实验表明,转基因烟草在600 mmol/L NaCI胁迫25天后能够恢复正常生长并结实,而野生型烟草则萎蔫死亡。这些实验表明LcChi2基因提高了转基因烟草的抗病性和耐盐碱和干旱胁迫的能力,我们推测该基因可能是通过参与渗透平衡调节来提高植物的耐盐碱能力。LcTpxll基因的开放读码框含有489个碱基,编码162个氨基酸,分子量约为17.4 kDa,具有硫氧还蛋白过氧化物酶保守结构域,属于Ⅱ型硫氧还蛋白过氧化物酶亚家族,定位于细胞核和细胞质中。LcTpxll基因与玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的硫氧还蛋白过氧化物酶基因高度同源,氨基酸序列相似性分别为90%、87%和75%。将LcTpxll蛋白在大肠杆菌中进行原核表达和纯化,优化了表达条件并对纯化的蛋白进行了体外酶活性分析和保护质粒抗氧化分析,结果表明LcTpxll蛋白最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导2h。LcTpxll蛋白不仅具有还原分解H2O2的能力还具有保护质粒抗氧化的功能。利用半定量RT-PCR的方法分析了LcTpxll基因在盐碱胁迫下的表达情况,结果表明该基因在400 mmol/L NaCl和100mmol/L Na2CO3胁迫下表达上调,说明该基因的表达可能与羊草耐盐碱胁迫有关。为了进一步研究该基因的功能,将LcTpxll基因通过LiAc法转入酿酒酵母INVSc1中。酵母耐盐碱实验表明,在10 mmol/L Na2CO3和1.6 mol/L NaCl的胁迫下,转基因酵母的生长好于对照,说明LcTpxll基因可以提高转基因酵母的耐盐碱能力,我们推测该基因可能是通过清除过氧化产物,减轻氧化胁迫的伤害来提高酵母的耐盐碱能力。LVAP1基因的开放读码框含有498个碱基,编码165个氨基酸,分子量约为16.6 kDa,具有ATP酶保守结构域,属于ATPase c亚家族。在N端有一个信号肽和四个跨膜结构域,属于疏水性蛋白,定位于细胞膜上。LVAP1基因与小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays),水稻(Oryza sativa)和高粱(Sorghum bicolor)液泡H+-ATPase c亚基基因高度同源,氨基酸序列相似性分别为100%、99%、99%和99%,说明该基因在进化上非常保守。利用半定量RT-PCR的方法分析了LVAP1基因在盐碱胁迫下的表达情况,结果表明该基因在400mmol/L NaCl和100 mmol/L Na2C03胁迫下表达上调,说明该基因的表达可能与羊草耐盐碱胁迫有关。为了进一步确定该基因的功能,将LVAP1基因通过LiAc法转入酿酒酵母INVSc1中。酵母耐盐实验表明,在1.6 mol/L NaCl的胁迫下,转基因酵母的生长好于对照,说明LVAP1基因可以提高转基因酵母的耐盐能力。同时,将LVAP1基因通过农杆菌介导法转化模式植物烟草。转基因烟草萌发期胁迫实验表明,在200 mmol/L NaCl和500mmol/L山梨醇的胁迫下,转基因烟草的长势好于野生型。转基因烟草苗期的耐盐实验表明,转基因烟草在600 mmol/L NaCl胁迫25天后能够恢复正常生长并结实,而野生型烟草则萎蔫死亡,表明LVAP1基因提高了转基因烟草的耐盐能力,我们推测该基因可能是通过参与离子平衡调节来提高植物的耐盐能力。综上所述,本文利用羊草的EST文库和RACE技术克隆得到了三个与耐盐碱相关的功能基因,包括几丁质酶基因、硫氧还蛋白过氧化物酶基因和液泡H+-ATPase c亚基基因,并在NCBl上注册Genbank号。我们在模式生物酵母和烟草中对功能这些基因进行了功能分析,在这些基因原有功能的基础上,增加了耐盐碱的功能。对这三个基因功能的验证表明这三个基因都与植物耐盐碱相关,说明植物耐盐碱是一个复杂的多基因调控的过程。本文获得的耐盐碱功能基因不仅可以为培育耐盐碱农作物提供重要的基因资源,同时对这些基因功能的研究也为解析植物耐盐碱分子机制提供了重要的理论依据。更多还原

【Abstract】 Due to persistent shrinkening of agricultural area, it has increasing demand in development of the saline-alkaline soil. One of the strategies for crop breeding is to increasing plant tolerant capability to saline-alkaline stress through genetic improvement. Leymus chinensis (Trin.) Tzvel., a xerophilous grass, is adapted to saline-alkaline soil. It must have developed molecular and physiological mechanisms to adapt itself under such stress conditions. Therefore. Leymus chinensis is considered a material for study the molecular mechanisms of saline-alkaline tolerance.In this study, three genes encoding chitinase. thioredoxin peroxidase and vacuolar H+-ATPase c subunit were cloned from Leymus chinensis EST library by RACE and registed on the NCBI (GQ397277. GQ397275 and GQ397276) named LcChi2. LcTpxll and LVAPL. respectively. The nucleic acid and protein sequences of these genes were analysis by bioinformatics methods, and subcellular localization of these three genes were tested by confocal laser microscopy. LcTpxlI was expressed and purified from E. coli. and the activity of the purified protein was analyzed. The results showed that LcTpxlI could not only reduce H2O2. but also protected of the plasmid antioxidant. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of the three genes under saline-alkaline stress. The results showed that the expressions of the three genes were up-regulated under saline-alkaline stress, indicating that these genes were responds to Leymus chinensis saline-alkaline tolerance. To further demonstrate the function of the three genes, the three genes were transformed into yeast. The transformed yeast grows better than the control under saline-alkaline stress, indicating that the three genes could increase the saline-alkaline tolerance to transgenic yeast. Finally. LVAP1 and LcChi2 were transformed into tobacco. The results showed that the transgenic tobacco grows better than the wild type under saline-alkaline stress, indicating that the two genes could improve the ability of transgenic plants against saline-alkaline stress. Meanwhile, the disease resistance of the LcChi2-transformed tobacco was improved, indicating that LcChi2 conferred the resistance of bacterial and fungal pathogens to the transgenic tobacco.Taken together, we successfully obtained three genes which were associated with saline-alkaline tolerance from Leymus chinensis EST library by RACE and registed on the NCBI. The functions of these genes were verified by transformed yeast and transgenic tobacco. These genes may be the interesting candidate genes to be used in breeding to improve saline-alkaline stress in crops and reform the saline-alkaline soil.更多还原