【作者】 蔡家利；

【导师】 蔡宝祥；

【作者基本信息】 南京农业大学 ， 预防兽医学， 1998， 博士

【摘要】 本课题在猪繁殖和呼吸综合征（PRRS）弱毒疫苗株克隆和鉴定的基础上，着重进行了PRRS病毒膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白基因的研究，主要包括以下几个方面： 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）疫苗弱毒株的克隆与鉴定 将从美洲和欧洲引进的2个PRRSV疫苗株进行了培养复壮，探讨了2个疫苗株的生长特征。并对美洲弱毒株进行了克隆、筛选和鉴定。克隆毒株最适宜生长的是MARC145细胞系，毒价可达10⁷TCID₅₀／ml，超薄切片电镜观察病毒子呈球形，大小50—60nm。同时探讨了PRRSV弱毒株的免疫特性。 二、PRRSV弱毒株M和N基因的克隆与鉴定 以PRRSV美洲毒株MN基因序列为模板、设计的一对能够合成MN基因的引物。采用RT—PCR成功扩增出一约900bp MN基因片段，构建了2个重组质粒PBVMN和PB-SMN。经酶切和部份序列测定得到证实。 三、PRRSV弱毒株M和N基因的序列分析 将MN基因的重组质粒PBSMN进行了完整的序列分析，阐明了PRRSV弱毒疫苗克隆株MN基因的分子特征。M和N基因分别位于ORF6和ORF7，以8bp重迭而相连，分别有一个起始密码子和终子密码子，N基因上游13个核苷酸有一前导序列基元的结合位点。与其它毒株比较，PRRSVMc与美洲毒株同源性较高（92—97％），与欧洲毒株同源性较低（60—67％）。M基因比N基因更保守。分析了常见的46种内切酶，发现在MN基因段有17个内切酶34个酶切位点。 四、PRRSVMc MN基因的表达 将重组质粒PBVMN进行了温敏诱导。SDS—PAGE电泳发现有一个约34KD的表达蛋白带，约占整个菌体的12％，但此表达蛋白免疫原性较差，Western—blot分析未出现阳性反应。 五、应用RT—PCR直接检测流产胎儿组织中的PRRSV，利用设计的能够扩增MN基因的引物和建立的RT—PCR方法，对可疑PRRSV感染的流产胎儿病理组织进行了检测，扩增出了与理论设计同样大小的cDNA片段。RT—PCR阳性标本通过病毒分离得到证实。更多还原

【Abstract】 Porcine reproductive and respiratory syndrome modified live viruses were imported from the United State and the Netherland. The modified live viruses were recuperated in MARC—145 cell line. The modified live virus of the U. S PRRSV was cloned at the limiting dilution. Cytopathic effects were observed on the MARC —145 cell monolayers infected with the cloned strain (PRRSVMc) in 72h postinfection. By 36h postinfection, the virions could be observed in ultrathin section of MARC —145 cell infected with PRRSVMc by electron microscope. Intracellular viral particles tended to accumulate within the cytoplasmic vesicles and appeared as spherical enveloped particles of 50— 60 nm in diameter. The PRRSVMc was identified by ELISA? 80 sera samples from the pigs which were suspected to be infected by PRRSV were detected by ELISA with the pure PRRSVMc antigen, 34 of which were found to be PRRSV positive. The positive rate is 42. 5%. It was possible that the antigen was made by using PRRSVMc. The report laid a basis for further research of PRRS modified vaccine.更多还原