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华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶底物特异性的定向改造  
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【英文题名】 Directed Modification to Substrate Specificity of Rhizopus Chinensis CTCCM201021 Lipase
【作者】 朱珊珊;
【导师】 喻晓蔚;
【学位授予单位】 江南大学;
【学科专业名称】 微生物学
【学位年度】 2012
【论文级别】 硕士
【网络出版投稿人】 江南大学
【网络出版投稿时间】 2012-06-15
【基金】 863 计划;国家 973;国家自然科学;
【关键词】 华根霉脂肪酶; 底物特异性; 组成型表达; GAP; 橄榄油罗丹明B; 盖子结构; 半理性设计; 理性设计;
【英文关键词】 Rhizopus chinensis lipase; Substrate specificity; Constitutive expression; GAP; Olive oil-rhodamine B; Lid; Rational design; Semi-rational design;
【中文摘要】 华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)作为一种典型的根霉属丝状真菌,不仅是传统酿造工业中的重要功能微生物,在现代发酵工业中也是许多工业用品和酶制剂的重要生产菌株。前期研究已经实现了华根霉脂肪酶基因(proRCL)(GenBank Accession No. EF405962)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达。本文在保留毕赤酵母诱导型启动子(AOX)两端同源重组序列的基础上插入组成型表达启动子(GAP),实现毕赤酵母组成型表达华根霉脂肪酶的作用。同时结合橄榄油罗丹明B平板,建立高通量的平板筛选法。选定脂肪酶盖子区域,运用半理性设计和理性设计的手段获得了一系列的活性和底物特异性改变的突变株,系统研究了盖子结构对脂肪酶活性和底物特异性的影响。具体内容包括: (1)运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上...
【英文摘要】 As a typical filamentous fungus Rhizopus chinensis CCTCC M201021 was an important functional strain in the brewing industry, which could produce many kinds of enzymes. In our previous studies, Rhizopus chinensis lipase gene (proRCL,GenBank Accession No. EF405962) had been cloned and high-level expressed in pichia pastoris GS115. In this study, the GAP promoter was inserted into the inducible expression vector pPIC9K-proRCL in order to introduce the double-crossover integration of the lipase gene into the ye...
【更新日期】 2012-07-02

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