【英文题名】
High Efficient Production of Purine Nucleoside Phosphorylase and L-tryptophan with Recombinant Escherichia Coli
【作者】
罗玮 ;
【导师】
徐志南 ;
【学位授予单位】
浙江大学 ;
【学科专业名称】
生物化工
【学位年度】
2011
【论文级别】
博士
【网络出版投稿人】
浙江大学
【网络出版投稿时间】
2011-12-16
【关键词】
重组大肠杆菌 ;
嘌呤核苷磷酸化酶 ;
L-色氨酸 ;
发酵条件 ;
分离纯化 ;
产率 ;
【英文关键词】
Recombinant Escherichia coli ;
Purine nucleoside phosphorylase ;
L-Tryptophan ;
Fermentation conditions ;
Separation and purification ;
Yield ;
【中文摘要】
嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷补救代谢途径中的关键酶,在抗肿瘤基因治疗、核苷类药物合成等方面具有广泛的应用。L-色氨酸是人体八种必需氨基酸之一,在医药、食品添加剂、饲料等方面具有重要的市场发展前景。本文开展了在重组大肠杆菌中如何实现高效生产嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的系统研究。
首先构建了高效表达嘌呤核苷磷酸化酶基因的表达载体,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)宿主细胞中,构建了能够表达嘌呤核苷磷酸化酶的重组大肠杆菌。通过优化重组细胞的表达和诱导条件,实现了嘌呤核苷磷酸化酶的高效可溶性表达,最高表达水平达到196U/mL。进一步研究了重组酶的底物特异性,发现与非重组嘌呤核苷磷酸化酶的特性基本一致,并发现琼脂是一种较合适的固定化载体,开展了游离细胞和固定化细胞的酶学特性比较、反应动力学和稳定性研究。结果表明,细胞的固定化降低了重组细胞对底物的亲和力和催化效率,却显著提高其稳定性和反复使用性。固定化细胞催化的反应在较低底物浓度下由于扩散限制偏离了米氏方程规律,但在高浓度条件下依然遵守米氏方程规律,而游离细胞催化的反应均完全遵从米氏方程。以合成利巴韦林为例,开展了固定化重组细胞催化合成核苷类药物的研究。通过...
【英文摘要】
Purine nucleoside phosphorylase (PNPase, E.C.2.4.2.1) is a key enzyme in the purine salvage metabolic pathway. It could catalyze the synthesis of nucleosides, and has great potential in anti-tumour gene therapy. On the other hand, L-tryptophan (L-trp) is one of the eight essential amino-acids for human and widely applied in the fields of medicine, food additives and animal feeds. This study has respectively implemented the high production of PNPase and L-trp in the recombinant Escherichia coli.
Firstly,...
【更新日期】
2012-01-12
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