【英文题名】
Improve Substrate Specificity and Activity of Hyper-thermophilic Esterase by Protein and Solvent Engineering
【作者】
刘畅 ;
【导师】
冯雁 ;
【学位授予单位】
吉林大学 ;
【学科专业名称】
生物化学与分子生物学
【学位年度】
2011
【论文级别】
博士
【网络出版投稿人】
吉林大学；刘畅
【网络出版投稿时间】
2011-07-22
【关键词】
嗜热酯酶 ;
底物特异性 ;
半理性设计 ;
定向进化 ;
溶剂效应 ;
【英文关键词】
hyperthermophilic esterase ;
substrate specificity ;
directed evolution ;
semi-rational design ;
solvent effect ;
【中文摘要】
来源于超嗜热古菌Aeropyrum pernix K1酰基氨酰肽酶(APE1547)是具有酰基肽酶/酯酶等活性的多功能(promiscuous)酶,具有超常的生物学稳定性。本课题组在前期研究中,通过定向进化的方法,获得了酯酶活性提高的突变体P01(R526V),对系列对硝基苯酚酯底物表现良好的酯酶水解活性,最适酰基链长底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNP‐C8)。本文结合定向进化与半理性设计的蛋白质工程方法和溶剂工程技术,增加该酶对长链酰基底物的活性和选择性,并对酶活性和底物选择性与酶细微结构之间的关系进行了深入的分析。采用的研究方法和取得的结果如下:
1、以P01为出发酶,应用非理性的定向进化方法,对其催化结构域基因进行易错PCR后与推进器结构域连接,转化BL21菌,在多重选择压力下(高温及不同长度碳链的底物),应用优化的高通量筛选方法,筛选了万余株突变体,发现1个远离活性中心18.2(?)的关键位点T560,得到突变体E01(R526V/T560W)。催化动力学分析发现:E01对pNP‐C12的亲和力(1/K_m值)是P01的9.7倍,转化数(kcat值)是P01的1.5倍,因此催化效率(k_(cat)...
【英文摘要】
An acylaminoacyl-peptidase (apAAP) from hyperthermophilic archaea Aeropyrum pernix K1 is a promiscuous acyl peptidase and esterase. Our previous studies showed that saturation mutation of conservative residues R526 near the active site can effectively improve the esterase activity, but does not change the selectivity to pNP-ester. In order to fulfill the urgent requirement of thermostable lipolytic enzymes, the substrate preference of apAAP was further improved from p-nitrophenyl caprylate (pNP-C8) to p-nit...
【更新日期】
2011-08-23
【相同导师文献】
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