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胆固醇氧化酶亲和纯化及酶稳定性研究  
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【英文题名】 Affinity Purification and Enzyme Stability of Cholesterol Oxidase
【作者】 陈亦;
【导师】 王武;
【学位授予单位】 江南大学;
【学科专业名称】 生物化学与分子生物学
【学位年度】 2013
【论文级别】 硕士
【网络出版投稿人】 江南大学
【网络出版投稿时间】 2013-07-24
【关键词】 胆固醇氧化酶; 亲和纯化; 酶稳定性; 圆二色性; 添加剂; 固定化;
【英文关键词】 Cholesterol oxidase; Affinity purification; Enzyme stability; Circular; dichroism; Chemical additives; Immobilization;
【中文摘要】 酶的稳定性是限制酶制剂应用的重要因素，如何提高酶的稳定性是近年来酶工程研究的热点。本实验室构建一株可胞内表达胆固醇氧化酶(COD)的基因工程菌(E.coliBL21(DE3)/pET28a-COD)，但是由于该酶稳定性不佳，限制了它的应用。本论文首先建立高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法，并通过分析纯酶的失活机理，分别采用添加剂和固定化的策略提高酶的稳定性。主要研究成果为： (1)构建不同类型的亲和介质，建立高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法。以胆固醇氧化酶辅酶FAD的结构类似物为配体，选择不同连接臂，以琼脂糖为基质，合成不同亲和介质，以2-羟基-1,3-丙二胺连接臂，2,4-六氢嘧啶-5-羧酸、7-氯咯嗪和8-氯咯嗪为亲和配体的介质获得纯度较高的酶，其中以8-氯咯嗪为配体的介质的活性回收率最高，为98.2%，该介质最大理论吸附量为82.5mg/g，解离常数为0.6μg/mL。 (2)利用凝胶电泳、荧光光谱及圆二色性光谱等方法，研究液态胆固醇氧化酶失活机理。研究表明，液态胆固醇氧化酶失活因素涉及酶分子间聚集，导致构象变化以及表达过程中未能充分结合辅基FAD。 (3)根据酶的失活机理，研究...
【英文摘要】 The stability of enzymes is one of the bottleneck problems for its applications, andimprovement of enzyme stability is a hot topic in the enzyme engineering. A recombinantstrain (E.coli BL21(DE3)/pET28a-COD), expressed cholesterol oxidase (COD) intracellular,was constructed in the laboratory, however, the application of cholesterol oxidase was limiteddue to its poor stability. In the paper, affinity protocols were developed for the preparation ofpure cholesterol oxidase, enzyme inactivation mechanisms were ...
【更新日期】 2013-09-02

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