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动物源细菌对四环素类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研制  
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【英文题名】 Development of the Detection Kit of Tetracycline-resistance Genes in Bacterial Isolates from Animals by Multi-PCR Method
【作者】 夏青青;
【导师】 王红宁;
【学位授予单位】 四川农业大学;
【学科专业名称】 预防兽医学
【学位年度】 2008
【论文级别】 硕士
【网络出版投稿人】 四川农业大学
【网络出版投稿时间】 2008-12-08
【基金】 国家农业科技成果转化基金;
【关键词】 四环素类药物; 耐药基因; 三重PCR; 检测试剂盒;
【英文关键词】 tetracycline; resistance genes; multi-PCR; detection kit;
【中文摘要】 本研究使用测序菌株作阳性对照,药敏质控菌ATCC25922抽提的DNA作阴性对照,建立了动物源细菌对四环素类药物耐药基因三重PCR检测方法。同时,针对Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物等组份用量及退火温度、循环次数等循环参数进行优化并组装试剂盒。优化结果如下:10×PCR Buffer 5μL,浓度为25mM/LMgCl_23.0μL,浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μL,浓度为2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.35μL,浓度均为25mmol/L三种耐药基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特异性上下游引物(25 mmol/L)分别1.0μL、0.3μL、0.4μL。将其置于一无菌的PCR反应薄壁管中,加入已制备好的模板5μL,补水至总体积50μL后加入20μL矿物油封顶即可。经过反复实验对试剂盒的反应条件进行优化,最优PCR扩增循环参数为:94℃预变性5min;然后进入循环:94℃变性60s、56℃退火60s、72℃延伸60s,共35个循环,最后72℃延伸10min后,电泳观察结果。 应用本检测试剂盒和传统药敏试验方法(K...
【英文摘要】 The positive control was obtained from the samples reserved in our laboratory by PCR method.The negative control is the DNA extract from E.coli ATCC25922.A multi-PCR detection method was established.In order to fred out the best reaction parameter we optimized Mg~(2+)、dNTPs、Taq enzyme and primers concentration,the best annealing temperature and the best cycle number of times.The final reaction system was shown as follows:10×PCR Buffer 5μL,MgCl_2 (25 mmol/L) 3.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 4μL,DNA template 5μ...
【更新日期】 2008-12-30

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导师:王红宁    导师单位:四川农业大学    学位授予单位:四川农业大学
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