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豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究     在线阅读　整本下载　分章下载　分页下载 本系统暂不支持迅雷或FlashGet等下载工具
【英文题名】 Directed Evolution of Douchi Fibrinolytic Enzyme and Expression of Mutant Enzyme Gene
【作者】 张少平;
【导师】 郭勇;
【学位授予单位】 华南理工大学;
【学科专业名称】 发酵工程
【学位年度】 2010
【论文级别】 博士
【网络出版投稿人】 华南理工大学
【网络出版投稿时间】 2011-03-23
【关键词】 豆豉纤溶酶; 定向进化; 基因表达; 发酵条件优化;
【英文关键词】 Douchi fibrinolytic enzyme; Directed evolution; Gene expression; Optimization of fermentationconditions;
【中文摘要】 豆豉纤溶酶(Douchi fibrinolytic enzyme,DFE)是从中国传统发酵食品豆豉中发现的新型纤溶酶,具有开发成新一代溶栓药物和相关功能食品的巨大潜力。本文从产纤溶酶的枯草芽孢杆菌DC12中克隆豆豉纤溶酶基因并对其进行了验证,在此基础上通过定向进化得到催化效率提高的突变酶,将突变酶基因在枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷株WB800中进行了诱导型分泌表达及发酵优化。主要内容与结果如下: 利用PCR技术从产纤溶酶的枯草芽孢杆菌DC-12中扩增豆豉纤溶酶基因,为验证豆豉纤溶酶基因正确与否以及方便在后续研究中对随机突变文库的筛选,将豆豉纤溶酶基因连接到表达载体pET-32a中,构建豆豉纤溶酶重组表达质粒然后转化到E.coli BL21(DE3)中,重组菌株于37℃培养至OD600为0.6左右,加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG于24℃进行诱导,SDS-PAGE显示表达产物同时存在于菌体破碎后的上清液和沉淀中,菌体破碎后上清液的纤溶酶活力为200 IU/mL。通过Ni-NTA亲和柱层析和Sephadex G-75分子筛层析对重组豆豉纤溶酶进行纯化,得到分子量约为28 kDa的目的蛋白,重组蛋白纯化...
【英文摘要】 DFE(Douchi fibrinolytic enzyme) is a new fibrinolytic enzyme which was discovered in Douchi. DFE is worthy developing as either natural thrombolytic agent or health food to prevent thrombotic diseases.The gene encoding pro-DFE from DC-12 was cloned and expressed in E. col.i The catalytic efficiency of DFE was improved by directed evolution. The mutant DFE was expressed in Bacillus subtiilis WB800 by induction with IPTG and the fermentation conditions were optimized. The main results of the thesis are as fol...
【更新日期】 2011-07-01

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