传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

【摘要】 通过PCR方法,删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORFA1和ORFA2非重叠区的33bp(96~129bp)的同时,引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记,构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3,与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞.用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞,模拟病毒“传代”.结果表明,细胞的形态学特征发生变化,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE).电子显微镜观察显示,在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子.间接免疫荧光分析结果表明,拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达,而非结构蛋白(VP5)则不能表达.针对A节段的RT-PCR,酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入.ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡,相对HZ2株致死率(20%)明显下降.本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统,构建了IBDVVP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株,为IBDV基因组学的研究提供了新方向,为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.更多还原