应用差异显示技术从高低转移癌系克隆出肿瘤转移相关基因G3BP

【摘要】 目的　克隆肿瘤转移相关基因。方法　应用倍比稀释法对人肺巨细胞癌PG进行单细胞克隆 ,并应用裸鼠异种接种及自发性转移体内实验对各亚系的转移潜能进行鉴定。以具有不同转移潜能的癌细胞亚系为研究对象 ,应用mRNA差异显示技术克隆差异片段 ,sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列 ,与GenBank数据库进行同源性比较。在两组具有不同转移潜能的癌细胞亚系 (人肺癌 ,前列腺癌 )中Northern杂交验证表达差异。结果　两个具有不同转移潜能的亚系BE1和LH7,在完全相同的遗传背景下 ,亚系BE1在裸鼠体内 10 0 %成瘤 ,10 0 %转移 ;亚系LH7在裸鼠体内 10 0 %成瘤 ,无一例转移。二者转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因表达与调控的差异。因此该系统是mRNA差异显示的良好模型。应用mRNA差异显示技术克隆差异片段 ,一个84 9bp片段在高转移亚系BE1中低表达 ,而在不转移亚系LH7高表达 ,二者差异显著 ,在重复实验中得到了验证。成功的回收该片段 ,连接入pGEM T载体 ,经sanger双脱氧末端终止法测序及自动双向测序获得其碱基序列 ,经GenBankBlastn检索 ,与G3BP(U32 519)同源性高达 99%。Northern杂交显示G3BP在LH7高表达 (约 3 3kb) ,而在BE1中低表达 ,验证了差异显示的结果 ,排除了假阳性的可能性更多还原