SERPINF2促进磷酸钙结晶和激活MAPK信号通路促进成骨分化和矿化

【作者】 刘东凯； 付宇； 丁雪梅； 白世平； 曾秋风； 刘艳； 齐广海； 张克英； 王晶； 王建萍；

【机构】 四川农业大学动物营养研究所； 中国农业科学院饲料研究所；

【摘要】 (引言)蛋壳形成主要发生于夜间,此时鸡只已停止采食、无外源钙摄入,需骨骼短时快速供钙;机体通过破骨细胞介导骨吸收释放钙,以保障蛋壳钙源。恢复采食后,外源钙经肠道吸收,大部分用于髓质骨重建,而皮质骨区域几乎无成骨细胞活性。随母鸡日龄增长,尤其产蛋后期,其肠道钙磷吸收效率及子宫钙转运能力显著下降,致髓质骨储钙无法满足产蛋需求,进而使皮质骨与骨小梁骨吸收占比升高,引发皮质骨变薄、骨小梁数量减少且连接丧失,最终导致骨骼脆弱化,鸡群骨折几率大幅上升。(目的)本研究通过比较产蛋高峰期(34周龄)与产蛋后期(75周龄)京红1号蛋鸡股骨的品质、微观结构、力学特征及化学组分,探究产蛋后期蛋鸡骨骼质量下降的分子机制,为延长蛋鸡产蛋周期、研发骨骼健康保护措施提供基础数据与理论依据。(方法)采用单因素试验设计,设2个处理组(产蛋高峰期组、产蛋后期组),每组6个重复,每重复20只鸡(5只/笼),试验期1周。试验第4天起连续3天采集蛋样(-20℃保存,待测蛋壳品质);第7天每重复选3只体重相近蛋鸡,颈静脉采血后脱颈处死,分离左腿股骨(-20℃保存,待测骨骼品质与力学特征),右腿股骨剖开后生理盐水冲洗髓腔,取皮质骨(-80℃保存,待测微观结构与化学组分)。体外矿化:磷酸钙的制备体系,构建含CaCl?,K?HPO?溶液和HEPES缓冲液的混合溶液,试验组加入SERPINF2蛋白(对照组补充等量缓冲液以维持体系体积一致)。将混合溶液滴加至带有封口膜的标准24孔板中,孔板底部预先放置亲水性载玻片作为晶体生长基底,于37℃恒温培养箱中反应48h。反应结束后,室温干燥24h后进行后续表征。MC3T3-E14细胞系培养:MC3T3-E14细胞在补充有10%FBS和1%青霉素和链霉素的α-MEM中培养。为了测定SERPINF2的成骨活性,将MC3T3-E14细胞在细胞培养板中以2×105的密度培养过夜,然后在成骨诱导培养基中用指定浓度的SERPINF2处理。成骨诱导培养基每隔2天更新一次。分化第3天测定成骨分化转录因子的基因表达,14天进行ALP和ARS染色。(结果与讨论)结果表明:1)与产蛋高峰期蛋鸡相比,产蛋后期蛋鸡蛋壳品质(蛋壳质量,蛋壳厚度,蛋壳强度,蛋形指数,蛋壳Ca,P的含量)显著下降(P<0.05);2)与产蛋高峰期蛋鸡相比,产蛋后期蛋鸡骨骼品质(BMC,BMD,断裂强度,灰分中Ca,P含量)显著下降(P<0.05);3)与产蛋高峰期蛋鸡相比,产蛋后期蛋鸡股骨CT.h,CT.BMD,CT.BMC,Tb.BV,Tb.BV/TV,Mb.BV,Mb.BS显著下降(P<0.05);4)与产蛋高峰期蛋鸡相比,产蛋后期蛋鸡血浆Ca,P含量显著下降(P<0.05)5)与产蛋高峰期蛋鸡相比,产蛋后期蛋鸡共筛选出360个差异表达蛋白(DEPs):其中281个上调、79个下调(P<0.05,FC>1.5)。DEPs主要定位于细胞质、细胞内解剖结构及细胞质溶胶,分子功能以蛋白质结合、RNA结合为主,且参与蛋白质代谢过程调节、翻译调控及翻译起始调控等生物过程。KEGG富集分析显示,前5位代谢通路为代谢途径、RNA转运、剪切体、内质网中的蛋白质加工及钙信号通路;通过PPI蛋白互作网络分析,筛选出关键蛋白TRIP12,TRIP12是泛素连接酶E3主要起到标记靶蛋白的作用,产蛋后期TRIP12的异常上调可能导致众多调控成骨分化和矿化的蛋白被蛋白酶体分解。此外,产蛋后期下调DEPs富集于丝氨酸型肽酶抑制剂活性及MAPK信号通路,PPI分析筛选出关键蛋白SERPINF2;6)体外模拟磷灰石形成试验中发现,添加SERPINF2会促进磷灰石的结晶,且结晶体的孔隙率和粗糙度显著高于对照组(P<0.05);7)与对照组相比添加SERPINF2组的成骨细胞P38,ERK的表达显著升高,ALP,RUNX2,COL1,OCN mRNA的表达显著升高,钙盐沉积量和ALP含量显著升高(P<0.05)。(结论)产蛋后期蛋鸡骨骼品质下降的主要原因在于钙磷沉积减少和结构骨骨丢失严重。蛋白酶体功能的紊乱和丝氨酸型肽酶抑制剂家族活性异常降低可能是结构骨丢失的重要原因。SERPINF2促进磷酸钙有序生长和结晶,通过激活MAPK信号通路促进成骨分化和矿化,在皮质骨形成和结构完整上发挥重要作用。更多还原