基于单细胞转录组测序解析家禽胚胎肌纤维命运决定机制

【作者】 孙云霄； 李贞； 揭育辰； 杨宁； 尹忠涛； 侯卓成；

【机构】 中国农业大学动物科技学院；

【摘要】 引言骨骼肌是脊椎动物运动的基石,其主要依赖于功能不同的肌纤维类型。尽管肌生成中的细胞动力学已被广泛研究,但控制纤维类型多样化的发育起源和途径仍未得到解决。在这里,我们构建了相对完整的家禽胚胎期肌纤维单细胞图谱,为深入解析家禽胚胎期肌纤维命运决定机制提供了新的视角以及数据支撑。材料与方法本研究以200枚北京鸭受精蛋为实验材料,在严格控制的环境条件下(37.5±0.2℃、55±2%相对湿度)进行标准化孵化,每2小时自动翻蛋1次以确保胚胎正常发育。基于系统性的发育观测方案,在孵化初期(0-72小时)每小时观测胚胎发育情况,E5-E9阶段每12小时对胚胎进行观察,E10至孵化期间则每24小时对胚胎进行观察。根据胸肌组织的形态学发育特征,我们将胸肌发育过程科学划分为早期、中期和晚期:(1)早期:E3、E5、E7、E9;(2)中期:E12、E15、E18;(3)后期:E21、E24、E28(孵化后1天)。考虑到胸肌在E5前尚未分化,我们在E3和E5时间点采集全胚胎样本,从E7开始则专门分离胸肌组织,每个发育时期至少获取5个生物学重复样本,最终共选取10个具有代表性的发育时间节点进行单细胞转录组测序。结果利用10x Genomics单细胞RNA测序技术,我们对北京鸭的胚胎期骨骼肌单细胞数据进行质控。为了深入探究肌纤维的发育机制,我们提取了与肌纤维相关的细胞类群。肌核分类的异质性基于之前与肌纤维相关的标记:表达TNNI1和TNNC1的I型肌核,以及两种已知的II型肌核(TNNI2、TNNT3)亚型:一种表达MYH2(IIa型),另一种表达MYH1B(IIx型),以及共表达快和慢肌纤维标记的杂交肌核(TNTC1、TNNC2)。在胚胎发育过程中,我们发现,I型肌核通常减少,而I/II杂交肌核和II型肌核相对丰度增加。根据细胞类型标记的表达对所有9种肌纤维亚型进行了注释。进一步的亚群鉴定了两种特殊的肌核:神经肌肉接头(NMJ)和纤维脂肪生成祖细胞(FAP)。NMJ显示与轴突引导(AGRN)相关的基因富集。具有脂肪细胞样特性的成纤维细胞肌核共表达脂肪生成标志物(PPARG、LPIN1、CEBPD)和成纤维细胞标志物(DCN)。值得注意的是,I型肌纤维特异性肌核(以MYMK、NEBL和LEF1为标志)在胚胎发育中期主要富集(E12-E18;～86.98%)。相比之下,II型肌纤维特异性肌核在中晚期发育(E12-E28)期间表现出渐进性优势,MSTN+(II)和CSRP3+(IIx)肌核分别在E12和E18可检测到,并持续到E28,MUSTN+(IIx型)肌核主要在E28出现(～79.2%)。讨论与结论本研究采用10x Genomics单细胞RNA测序技术,成功构建了北京鸭胚胎期骨骼肌发育的高分辨率单细胞转录图谱,并将胚胎期肌纤维命运决定机制进行可视化。在禽类肌纤维形成过程中,我们观察到肌纤维的类型发生了显著的动态变化,包括肌核类型的转变和基因表达的重编程。该研究不仅为理解禽类骨骼肌肌纤维发育的分子机制提供了新的细胞层面见解,也为家禽肌肉品质的遗传改良和比较发育生物学研究奠定了重要理论基础。更多还原