转录组测序揭示CRP对丝羽乌骨鸡黑色素细胞增殖及黑色素生成的调控机制

【作者】 潘豫仙； 岳昕； 孙振； 陈文； 黄艳群；

【机构】 河南农业大学动物科技学院；

【摘要】 引言:黑色素细胞在体色形成、免疫调节及光保护中起关键作用。丝羽乌骨鸡因独特黑色素沉积特性成为研究黑色素细胞功能的理想动物。近年来,CRP作为一种新发现的色素沉积候选基因,其生物学功能日益受到关注。本实验室前期研究发现CRP基因在乌骨鸡胸肌中表达显著高于AA肉鸡,提示其可能作为新的色素沉积调控基因参与乌骨鸡特征表型的形成。然而,目前关于CRP在黑色素细胞中的具体调控机制仍不清楚。为此,本研究通过建立CRP过表达细胞模型,整合高通量转录组测序和多种细胞功能分析技术,系统探究了CRP对黑色素细胞生物学功能的调控作用。该研究不仅为阐明CRP在黑色素代谢中的分子机制提供了新的理论依据,同时也为家禽遗传育种中的黑色素沉积调控以及相关疾病研究提供了潜在的分子靶点和新的研究思路。材料与方法:选取20胚龄的丝羽乌骨鸡胚蛋,采集其腹膜组织以分离并培养黑色素细胞。随后,将pcDNA3.1(NC组)和pcDNA3.1-CRP(OE组)分别转染至黑色素细胞中,进行后续检测。通过RNA-seq测定转录组水平,采用CCK-8法检测黑色素细胞的增殖活力,利用碱溶法测定黑色素含量,借助FontanaMasson染色观察黑色素颗粒,同时通过透射电镜观察黑色素小体的数目。结果:OPLS-DA分析显示,NC组与OE组内样本聚集好、组间分散显著,转录组特征差异明确。基于转录组数据,以|log2FoldChange|≥0且P_value <0.05为标准,筛选出461个差异表达基因,其中上调208个、下调253个。GO功能富集分析表明,差异基因主要参与细胞内受体信号通路、免疫反应、脂质代谢等生物学过程,主要定位于黑素小体、色素颗粒等细胞组分,具有类固醇结合、核受体活性等分子功能。KEGG富集结果显示,差异基因显著富集于细胞外基质-受体相互作用、粘着斑、酪氨酸代谢、VEGF信号通路等,影响黑色素细胞的生物学功能功能。CCK-8检测结果显示,转染36h和48h时,CRP对黑色素细胞的增殖具有促进作用;碱溶法测定结果表明,过表达CRP后黑色素含量无显著变化;而Fontana-Masson染色观察到,CRP能促使黑色素颗粒显著增多,透射电镜结果也显示CRP能使黑色素小体显著增多。讨论:CRP作为重要炎症标记物,可调控IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子,而炎症微环境影响黑色素合成,可能通过细胞信号网络间接作用于色素沉积。Wang等发现CRP可刺激VEGF表达,VEGF信号通路与炎症中血管通透性调节相关,还可能通过调控细胞迁移参与色素沉积,这与本研究转录组中该通路显著富集的结果一致,提示其可能是CRP连接炎症调控与黑色素细胞色素沉积的重要介导者。在畜禽色素沉积研究中,李东华、刘航等分别通过转录组测序、转录组与蛋白组联合分析,均将CRP列为乌骨鸡肤色色素沉积候选基因;周鑫等发现鸡胫骨组织中CRP差异表达,可能通过调控OCA2基因间接影响黑色素生成,但CRP与黑色素合成的直接关系仍需进一步研究。细胞功能层面,CCK-8检测显示CRP在转染36h和48h可促进黑色素细胞增殖,可能通过影响细胞周期相关基因或通路调控细胞生长。碱溶法显示过表达CRP对黑色素含量无显著影响,然而,Fontana-Masson染色和透射电镜观察发现CRP能显著增加黑色素颗粒和小体数量,结合GO分析显示差异基因在色素颗粒、黑素小体形成、脂质结合等功能上富集,提示CRP主要通过调控黑色素颗粒的包装、小体成熟及转运过程影响黑色素沉积,而非直接调控合成总量。该研究首次在细胞水平揭示了CRP对黑色素沉积的直接调控作用,也为家禽黑色素沉积机制研究及遗传育种分子标记筛选提供了潜在靶点。更多还原